ヘッドスペースガスクロマトグラフィー:ゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を評価する技術

要約

出典:Lovely, C. B. et al.ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを使用したゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルの定量化。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、ゼブラフィッシュの胚のエタノール濃度を測定するためのヘッドスペースガスクロマトグラフィーの使用を実演しています。この方法は、揮発性有機化合物の定性的および定量的分析に有用なツールを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 水置換を用いた胚の体積の測定

>注:このプロトコルでは、受精後24時間(hpf)胚(図1)が使用されます。体積測定に使用した胚は、エタノール分析には使用されません。

1. 10個の胚と胚体外液を、250 μLの容量で印を付けた1.5 mLの微量遠心チューブに入れます(図2A)。250 μLの充填ラインに水を加えます(図2Bの染色水を含むサンプルを参照)。
2. 手順1.1を繰り返して、絨毛膜が除去された胚のレセプタクルを設定します。
   1. 絨毛膜を除去するには、胚を絨毛膜に入れ、2 mg / mLのプロテアーゼカクテルを入れた100 mmのペトリ皿に入れ、室温(RT)で10分間胚を入れます。数分ごとに、胚を優しく渦巻いて絨毛膜を壊します。
   2. すべての胚が絨毛膜から解放されたら、プロテアーゼカクテル/胚培地から脱毛した胚を取り出し、新鮮な胚培地を入れた新しい100mmのペトリ皿に入れて胚を洗浄します。この洗浄手順をさらに1回繰り返します(合計2回の洗浄)。胚を新鮮な100mmのシャーレに移します。
3. できるだけ小さな先端を使用して、胚を傷つけないように、p200マイクロピペッター(図2C)を使用して胚の周りからすべての液体を慎重に取り除き、<0.1mgの精度で水の重量を量ります。10個の胚のサンプルの体積を決定するには、250μLから除去した水(1mLの水=1gの水)の重量/体積を差し引きます。1つの胚の体積を決定するには、250μLと除去した水の重量との差を10.
   で割ります
   

2. エタノールによる胚の処理

1. 交配タンクから胚を採取し、標準的な100mmのシャーレに入れます。1つのシャーレあたり100個以下の胚をカウントし、28.5°Cでインキュベートします
   手記：絨毛膜を除去する場合(ステップ1.2)、エタノールを添加する前に絨毛膜を除去する必要があります。
2. 6 hpfで、胚培地または胚培地+ 1%エタノール(v / v)を使用して、新しい標準100 mmペトリ皿に最大100個の胚を追加します。蓋をしますが、ペトリ皿を密封しないでください。胚を28.5°Cに設定された低温インキュベーターに18時間、または胚が発生時点である24 hpfに達するまで置きます。

3. ヘッドスペースガスクロマトグラフィー用の胚を処理する前のワークフローの準備

1. 5 M NaClを水に溶かし(サンプルチューブあたり450 μLが必要)、すべてのタンパク質を変性させ、エタノール代謝を防ぎます。胚培地中で2 mg / mLの濃度でプロテアーゼカクテルを調製します。
2. 各サンプルに1.5 mLの微量遠心チューブと2 mLのガスクロマトグラフバイアルを標識します。以下に説明するエタノール標準液用の追加の2 mLガスクロマトグラフバイアル、および空気、水、および5 M NaCl/プロテアーゼカクテルブランクを標識します。
3. 3台のp200マイクロピペッターを20 μLにセットし、3台目を200 μLに設定し、p1000マイクロピペッターを450 μLにセットし、p2マイクロピペッターを2 μLに設定します。ペトリ皿から1.5mLの微量遠心チューブに胚を移すために使用されるガラスピペットの場合、ピペットの先端をすばやく炎に通して端を滑らかにし、ピペットに胚を引き込むときに胚を傷つけないようにします。

4. 頭部宇宙ガスクロマトグラフィーのための胚の処理

>注:絨毛膜の胚と以前に絨毛膜から取り除かれた胚の両方が、希釈係数の計算における一貫性のために同じように扱われます。

1. 50 μLに設定された2つのp200マイクロピペッターを使用して、50 μLのプロテアーゼカクテル溶液を1つに引き込み、50 μLの水を2つ目に引き込みます。
2. ガラスピペットとマイクロピペットを使用して、10個の胚(ステップ2.2から)を1.5 mLの微量遠心チューブにすばやく入れ、キャップを閉じます(図2Aを参照)。試験するすべてのサンプル、コントロール、およびエタノール処理された胚について繰り返します。
3. 200 μLに設定したp200マイクロピペッターを使用して、キャップをすばやく開け、すべての残留胚培地を取り出します(図2Cを参照)。50 μLの水が入ったピペットをチューブにすばやく置き、すばやく、しかし穏やかに(胚を傷つけないように)追加してから水を取り除きます。待機中のピペッターから50μLのプロテアーゼカクテル溶液をすばやく加え、チューブキャップを閉じます(図2D).
   手記：このプロセスは、一度に 1 つのサンプルで実行します。
4. サンプルを室温で10分間放置し、プロテアーゼカクテルが絨毛膜を分解するのを待ちます。次に、5 M NaCl 450 μL をすばやく加え、チューブキャップを閉じます (図 2E)。サンプルを10分間ボルテックスします。プロセスを高速化するには、ミキサーを設定して、複数のサンプルを同時にボルテックスします。
   注:24 hpfより古い胚を含む任意のチューブに、少量(~100 μL)のシリカビーズ混合物(0.5 mmおよび1 mmビーズの2サイズ)を加えます。古い胚では、脊索は均質化される期間に関係なく無傷のままです。
5. 10分間均質化した後、2 μLの均質化した胚上清を迅速に取り出し、ガスクロマトグラフバイアルに加えます。バイアルをポリテトラフルオロエチレンキャップですばやく密封します。

5. 培地とエタノール標準液の調製

1. 培地標準液を調製するには、5 M NaCl/プロテアーゼカクテル溶液で培地を10倍に希釈します。各サンプル2μLをガスクロマトグラフバイアルに加え、ポリテトラフルオロエチレンキャップで密封します。
2. エタノール標準試料を調製するには、5 M NaCl/プロテアーゼカクテル溶液中の100%エタノールを0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、および40 mMの濃度で段階希釈します。各標準試料2μLをガスクロマトグラフバイアルに加え、ポリテトラフルオロエチレンキャップで密封します。

6. ヘッドスペースガスクロマトグラフィーの準備

>注:ヘッドスペースガスクロマトグラフィーは、分離のためではなく、エタノールレベルを定量するために使用されます。

1. オートサンプラーのヒーターを58°Cに設定し、電源を入れます。ヒーターが58°Cに達するのを待ち、ガスクロマトグラフに供給する空気および水素ガスラインをオンにします(エタノールの定量に使用される火炎イオン化用).
   注意: psiは、メーカーの仕様に従ってクロマトグラフを適切に操作するように設定する必要があります。ヘリウムラインがオンになっていて、適切なpsiに設定されていることを確認してください。
2. セプタムについては、注入するサンプルの数が>100でないことを確認してください。注入ファイバーの場合、注入するサンプルの数が>500.
   でないことを確認してください 注:どちらかが注入量を超えている場合は、テストサンプルを実行する前にそれらを交換する必要があります。
3. 解析ソフトウェアの電源を入れ、ワークステーションが正しく設定されていることを確認します。すべてのデータをラボ/部門の基準に従って保存します。実行するサンプルの新しいサンプルリストを作成します。
4. スタートアップメソッドを開始し、フレームイオン化検出器が安定するのを待ってから、サンプルを実行します。安定したら、ソフトウェアの起動方法を実行してファイバーをクリーニングします。

7. ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたサンプル測定

1. 起動方法が完了したら、サンプルリスト内のサンプルごとに1つの新しい行を作成します。解析ソフトウェアのメソッドメニューから、436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg runをロードします。サンプルリストの各サンプルのMETH。
   1. 空気、水、5 M NaCl/プロテアーゼカクテルブランクから始めて、サンプルリストに記入します。次に、0.3125〜40 mMの順序で標準を入力します。2回目のエア、水、5 M NaCl/プロテアーゼカクテルブランクで基準に従ってください。
   2. 試験するすべての均質化された胚上清サンプルを、予測されるエタノール濃度の最低から最高まで入力します。最後に、空気、水、5 M NaCl/プロテアーゼカクテルブランクの3回目と最終ラウンドに入ります。
2. ガスクロマトグラフバイアルを、サンプルが入力された順序でオートサンプラーに追加します。サンプルを10〜15分間温めます。ソフトウェアでサンプルランを開始します。
3. すべてのサンプルと最終ブランクを実行したら、サンプルリストに最終サンプルを追加し、スタンバイを実行して、ソフトウェアでシャットダウン方法をアクティブにします。覚せい剤。サンプルの実行中に集録したすべてのデータをバックアップします。オートサンプラーヒーター、水素タンク、クロマトグラフ温度が30°Cに達した後にのみエアタンクの順に機器の電源を切ります。ワックスカラムを保持するために、ヘリウムタンクはそのままにしておきます。

8. サンプルエタノールピーク積分とサンプル濃度分析

>注:8.3以降のすべての値は、すべての方程式が事前に入力されたExcelファイルで計算されました。

1. シャットダウン方法が完了したら、[クロマトグラムを開く]をクリックします。結果が格納されているフォルダを開きます。サンプルは、このプログラムに自動的に統合されます。
2. 結果では、正しいピークが波形解析されていることを確認してください(エタノールピークが 2 から 2.5 の間)。すべてのサンプルを確認したら、結果を印刷またはエクスポートします。
3. エタノール標準のピーク高さをグラフにプロットします。エタノール標準の傾き、Y切片、およびR²の値を計算します(R²は>0.99である必要があります).
   手記：これらの値は、サンプルのピーク高さからエタノール濃度を決定するために使用されます。
4. 各サンプルについて、エタノール標準のY切片からサンプルのピーク高さを差し引きます。この値をエタノール標準の傾きで割って、GCバイアルの各サンプルのエタノール値を求めます.
   
5. 胚中のエタノール濃度を計算するには、まず各サンプルの希釈係数を計算します。このプロトコルのステップ1.3で計算した体積測定値を取り、それを体積測定値に500μLを加えたもので割ります。これは、胚のプロセシング(ステップ4.3および4.4)中に各サンプルに添加される5 M NaCl/プロテアーゼカクテル溶液を表しています
   
6. このサンプル希釈係数を使用して、各サンプルのサンプルエタノール値を掛けます。結果は mM 濃度になります。培地のエタノール値に希釈係数10.
   を掛けて、培地参照サンプルを計算します
   

結果

図 1:絨毛膜内の受精後24時間(hpf)の胚の画像。胚と卵黄は胚外液に囲まれており、すべて絨毛膜の内側にあります。

図 2:胚の体積を測定し、分析のために胚を処理するためのプロトコル。(A)24 hpfの胚10個を、250 μLの容量で印を付けた1.5 mLの微量遠心チューブに移しました。(B)胚に水を入れた微量遠心チューブ(250μLマークで見やすいように水が染められています)。(C)チューブからすべての水を取り除き、計量します。(D)...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
オートサンプラー、CP-8400	バリアン		ガスクロマトグラフオートサンプラー
エタノール	デコンラボ	2701
ポリテトラフルオロエチレン/シリコンセプタムとプラスチックキャップ付きガスクロマトグラフバイアル2mL	アジレント	〒8010-0198	クリーニング後にバイアルを再利用できますが、キャップ/セプタムは再利用できません
ガスクロマトグラフ CP-3800	バリアン
ヘリウム			大学との契約により提供
HP Innowax キャピラリーカラム	アジレント	19095N-123I	30 m x 0.53 mm x 1.0 μm フィルム厚
ヒュルドゲン			大学との契約により提供
マイクロ遠心チューブ 1.5 mL	フィッシャーサイエンティフィック	2682002
マイクロピペットチップ 10 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611106
マイクロピペットチップ 1000 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611127
マイクロピペットチップ 200 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611112
Pipetman L p1000L マイクロピペット	ギルソン	FA10006M
Pipetman L p200L マイクロピペット	ギルソン	FA10005M
Pipetman L p2L マイクロピペット	ギルソン	FA10001M
ポリテトラフルオロエチレン/シリコンセプタムとプラスチックキャップ	アジレント	〒5190-7021	ガスクロマトグラフバイアルの交換用キャップ/セプタム
固相微量抽出繊維集合体カルボキセン/ポリジメチルシロキサン	ミリポアシグマ	57343-U	交換用繊維
スタークロマトグラフィーワークステーション	バリアン		クロマトグラフィーソフトウェア
サーモグリーンローブリード(LB-2)セプタム	ミリポアシグマ	23154	交換用インレットセプタム

名