1. 緩衝液と溶液の調製
>注:プロトコルで使用されるすべてのバッファとソリューションを表1にまとめます。所定のバッファー容量は、10個のサンプルを調製して実行するのに十分です。すべてのバッファーは、+4°Cで最大1年間保存できます。
- 蒸留水(dH2O)に1.5 Mアミノカプロン酸、150 mM Bis-trisを含む3倍ゲルバッファー20 mLを調製します。pHを7.0に調整します。
- 10mLの2Mアミノカプロン酸をdH2O中に調製します。
- 3x gel buffer 0.5 mL、2 M アミノカプロン酸 0.5 mL、500 mM EDTA 4 μL を組み合わせて、1 mL のミトコンドリアバッファーを調製します。
- 15 mMのBis-trisと50 mMのトリシンをdH2O中に含有する1,000 mLのカソードバッファーを調製し、pHを7.0に調整します。
- 0.04 gのCoomassie blue G-250を200 mLのカソードバッファーに加えて、200 mLの青色カソードバッファーを調製します。
- dH2Oに50 mM Bis-trisを含むアノードバッファー1,000 mLを調製し、pHを7.0に調整します。
- 750 mM アミノカプロン酸と 5% クマシーブルー G-250 を dH2O 中に含有する 2.5 mL のサンプルバッファーを調製します。
2. ミトコンドリア溶解物の調製
- 収集の前日に細胞をプレートします。HEK293または143B細胞には、10%ウシ胎児血清、1%L-グルタミン、100 mg/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用します。細胞培養インキュベーターで+37°Cの5%CO2加湿雰囲気で細胞を増殖させます。収集日に各サンプルに少なくとも500,000個の細胞があることを確認してください。
- 細胞を氷冷PBSで一度優しく洗います。プレートから細胞を剥がさないでください。細胞をこすり落とし、800 x gで+4°Cで10分間ペレット
状にします。
- 細胞ペレットを氷冷PBSで2回洗浄し、ステップ2.2のように遠心分離します。市販のキットを使用して、Bradford法でタンパク質濃度を測定します。細胞を800 x gで+4°Cで10分間ペレット化します
手記：細胞収集後、すべてのステップを+4°Cで実行し、ボルテックスしないでください。
- 20 mLのPBSに200 μLの100xプロテアーゼ阻害剤を加えて、プロテアーゼ阻害剤を含むPBS20 mLを調製します。氷の上を保ってください。プロテアーゼ阻害剤を用いてPBS中の細胞を最終タンパク質濃度5 mg/mLに再懸濁します。
- 細胞を5 mg/mLで再懸濁するために必要なプロテアーゼ阻害剤を含むPBSの量を計算するには、各サンプル中のタンパク質量を計算します。この計算には、ステップ2.3で測定したタンパク質濃度と、ステップ2.3で洗浄後に細胞を再懸濁するために使用したPBSの量を使用します。
- プロテアーゼ阻害剤を含むPBS中の3.3 mMジギトニン1 mLを調製します。3.3 mM のジギトニンを最終濃度 1.65 mM に加えます。よく混ぜ合わせ、氷上で5分間インキュベートします。
- プロテアーゼ阻害剤を含むPBS中の3.3 mMジギトニン1 mLを調製するには、4 mgのジギトニンをPBS1 mLに100°Cで溶解し、沈殿物が見えなくなるまで溶解し、すぐに氷上で冷却します。10 μLの100xプロテアーゼ阻害剤を1 mLのジギトニン溶液に加えます><。
手記：digitonin.
の新しい溶液のみを使用してください
注意：デジトニンは有毒です!フェイスマスク、手袋、白衣を使用してください。
- プロテイナーゼ阻害剤を含むPBS(ステップ2.4で調製)を最終容量1.5mLに加えます。10,000 x gで+4°Cで10分間遠心分離し、上清を取り除きます。このステップでは、ミトコンドリアがペレット化されます。
- ミトコンドリアペレットをミトコンドリア緩衝液に再懸濁します。ミトコンドリア緩衝液の体積は、ステップ2.4のPBSの体積の半分です。
- プロテアーゼ阻害剤を含むPBSに新鮮な10%ラウリルマルトシドを調製します(ステップ2.4で調製)。10サンプルに対して1mLで十分です。最終濃度の1%に10%のラウリルマルトシドを加えます。氷上で15分間インキュベートします(このステップは最大で数時間かかる場合があります)。
- 20,000 x gで+4°Cで20分間遠心分離し、上清を新しいチューブに集めます。キットを使用して、Bradford法によるタンパク質濃度を測定します。ステップ2.8で使用したラウリルマルトシドの半分の容量であるサンプルバッファーを追加します。サンプルは-80°Cで最大6か月間保存できます。
3. BN-PAGE用グラジエントゲルの作製
- BN-PAGE用のグラジエントゲルを室温で注ぎます。グラジエントメーカーを攪拌板に置き、フレキシブルチューブで蠕動ポンプに接続します。針付きの輸液セットをチューブに取り付けます。マグネチックスターラーをグラジエントメーカーの近位チャンバーに入れます。チューブをdH2Oで最大ポンプ速度で10分間洗浄します。
- チューブとグラディエントメーカーを空にします。ピペットを使用して、グラジエントメーカーのチャンバー間のチャネルに残っているdH2Oを取り除きます。バルブでチャネルとチューブを閉じます。
- キャスティングフレームとクランプを使用して、底に穴が開いているホルダーに2枚のガラス板を組み立て、スタンドに置きます。それが多かれ少なかれ水のバランスでまっすぐな表面にあることを確認してください。チューブに接続された針をガラスプレートの間に置きます。
- 6%および15%ゲル溶液を調製します(表2)。氷の上を保ってください。最後に過硫酸アンモニウム(APS)とテトラメチレンジアミン(TEMED)(重合を開始します)を追加します。気泡が入らないように優しく混ぜます。
- グラジエントゲルミキサーチューブチャンバーの近位端に6%ゲルを、遠位端に15%ゲルをロードします。ゲルの総体積は、ガラスプレート間の分離ゲルの体積と等しくなければなりません。したがって、2.6 mLの6%ゲルと2.1 mLの15%ゲルをグラジエントゲルミキサーに使用して、8.3 cm x 7.3 cmサイズのゲル1個を製造します。
- マグネチックスターラーのスイッチを入れ、グラジエントメーカーのチャンバー間のチューブとチャネルを開きます。蠕動ポンプを直ちに5 mL/minにスイッチを入れます。ガラスプレートを充填し、気泡がゲルに入らないようにします。チューブにゲルが入っていない場合は、針を取り外してください。
- ゲルをdH2Oで穏やかに重ね、重合のためにゲルを室温で少なくとも1時間保持します。
- ゲルを注入した直後に、グラジエントチャンバーにdH2Oを充填し、ペリスタルティックポンプを最大速度で使用してチューブを洗浄します。2つ以上のゲルを調製する場合は、必ずその間にシステムを清掃してください。
- 3 mLの3x gel bufferを混合して1x gel bufferを調製し、6 mLのdH2Oを加えます。濾紙でゲル表面からdH2Oを穏やかに取り除きます。ゲルの表面を1xゲルバッファーで洗浄します。1xゲルバッファーを濾紙で優しく取り除きます。
- ゲル上の濾紙からの繊維を避けてください。これを確実にするために、はさみで紙を細かく切りますが、紙を破らないでください。
- 櫛をガラス板の間に置きますが、櫛の下にスタッキングジェルを注ぐことができるように、櫛を完全に浸さないでください。4%スタッキングゲルを調製します(表2)。APSとTEMEDは重合が簡単に開始されるため、最後に追加します。気泡を避けてやさしく混ぜます。
- コームの下の気泡を避けてスタッキングジェルを重ね、コームを完全に浸します。スタッキングゲルを少なくとも30分間重合させます。コームを取り外し、ピペットを使用して1xゲルバッファーでウェルを洗浄します。
- 重合後、ゲルは+4°Cで数日間保存できます。ゲルを保管するには、ゲルの乾燥を防ぐために、dH2Oとプラスチックフィルムを染み込ませた紙でゲルを包みます。
>4. 青色天然ゲル電気泳動
>注:OXPHOS複合体の分解を防ぐために、+4°Cで電気泳動を実行します。
- ゲルカセットに青色カソードバッファーをウェルの底までロードします。サンプルのロードは、カセットが上部まで充填されていない方が簡単です。ウェルを青色カソードバッファーで洗浄し、ピペットを使用してウェルに青色カソードバッファーを充填します。
- サンプル(タンパク質5〜30μg)をウェルにロードします。ゲルカセットの上部に青色のカソードバッファーを、タンクにアノードバッファーを静かに充填します。
- ゲルを40Vの定電圧で15分間泳動します。次に、電圧を80 Vに上げ(または6 mAの定電流を使用)、10 mAを超えないようにします。染料がゲルの長さの2/3に達するまでゲルを流します。
- 青色のカソードバッファーをカソードバッファーに交換し、色素のフロントがなくなるまで電気泳動を続けます。電気泳動には合計で約3時間かかります。
- ガラスプレートを回収し、セミドライブロッティングによりタンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します。