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1. ビオチン化抗体によるアレイの機能化
- 次の解決策を準備します。
- T50バッファーは、10 mM Tris-HCl(pH 8.0)と50 mM NaClの溶液です。溶液はRTで1ヶ月間安定です。
- T50-BSAは、T50バッファーに0.1 mg/mLのBSAを添加します。調製した溶液を氷の上に置いておきます。
- 10 mg/mL の水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) を 1x PBS に溶解します。使用直前にご用意ください。
- 0.2 mg/mL の NeutrAvidin (材料表を参照) T50 バッファー中
注意： NaBH4は還元剤であり、可燃性です。使用後は必ず容器を窒素ガスでパージし、デシケーターで保管してください。
- ビオチン化抗体でアレイを官能基化します。
- PEG-ビオチン修飾アレイをフリーザーから取り出し、円錐管をRTに平衡化してから開封します。アレイを上に向け、カバースリップをシーリングフィルムで裏打ちされた100 mm組織培養(TC100)皿に置きます.
手記：頭上の照明を最小限に抑えます。すべてのソリューションは、疎水性アレイによって定義された正方形に「ビーズアップ」する必要があります。各正方形(通常は10〜15μL)を完全に覆うように適切な量の溶液を追加し、定義されたスペースに液体があふれないようにします。液体を迅速に除去するには、バキュームフラスコに取り付けられた社内のバキュームラインを使用して廃棄物を捕捉します。NaBH4を1時間脱気させてから、化学フュームフード内のチューブを開いたままにして廃棄してください。NaBH4処理は、バックグラウンドの自家蛍光を低減し、それによって偽陽性の単一分子検出を減らすために必要です。
- アレイの各正方形を10 mg/mLのNaBH4 in 1x PBSで室温で4分間処理し、PBSで3回洗浄します。
- 各正方形を0.2 mg/mLのNeutrAvidin含有T50と5分間インキュベートします。T50-BSA.
で3回洗濯します
手記：ニュートラアビジンはPEG-ビオチンに結合し、ビオチン化抗体の結合部位を提供します。
- T50-BSA中の2 μg/mLのビオチン化POI特異的抗体と各正方形を10分間インキュベートし、T50-BSAで3回洗浄します
手記：本プロトコルは、ビオチン化抗EGFR IgG(材料の表を参照)を使用してEGFR-GFPを捕捉します。
2. 全細胞ライセートからのPOIのSiMPull
>注:SiMPull調製の残りの部分のために、機能化されたSiMPullアレイのTC100ディッシュを氷上に置きます。このステップは、総タンパク質ライセートからのPOIのプルダウンです。ライセートは解凍後に再利用しないでください。
- 次の解決策を準備します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)/0.1%グルタルアルデヒド(GA)を1x PBS.
に調製します。
注意：PFAとGAは有毒な化学固定剤であり、発がん性物質の可能性があります。PPEを着用してください。化学物質は、地域の規制およびガイドラインに従って有害廃棄物として廃棄してください。
- 10 mM Tris-HCl(pH 7.4)を調製します。
- ライセートを解凍し、ピペッティングで静かに上下させて混合します。氷の上を保ってください。
- ライセート1 μLを氷冷T50-BSA/PPI.
に希釈します。
手記：必要に応じて、アレイにさまざまな希釈を適用して、全タンパク質ライセートの適切な希釈係数を決定します。アレイ領域あたりのSiMPull受容体の最適な密度は、0.04〜0.08 /μm2です。
- ライセートをアレイ上で10分間インキュベートし、その後、氷冷したT50-BSA/PPIで4回洗浄します。
- AF647標識抗ホスホチロシン抗体(材料表を参照)を氷冷T50-BSA/PPIで希釈し、アレイ上で1時間
インキュベートします。
手記：本プロトコルでは、PAN抗pTyr(PY99)-AF647 IgGを使用して、EGFR-GFPのリン酸化集団を同定します。直接標識された抗体を使用することで、二次抗体が不要になり、標識の選択肢が増え、結果の一貫性が向上します。蛍光標識抗体は、市販の供給元から入手できます。市販されていない場合は、標準的なバイオコンジュゲーション技術を使用して抗体をカスタム標識することができ、市販のバイオコンジュゲーションキットも入手可能です。蛍光標識抗体の各バッチは、SiMPullを実行して用量曲線を測定し、飽和点を見つけることにより、最適な標識条件で試験する必要があります。
- 氷冷したT50-BSAで合計6〜8分間6回洗います。
- 氷冷した1x PBSで2回洗います。
- アレイを4% PFA/0.1% GA溶液と10分間インキュベートして、抗体の解離を防ぎます。
- 10 mM Tris-HCl、pH 7.4/PBSでそれぞれ5分間2回洗浄し、固定剤を不活性化します
手記：複数の抗体を用いた実験(例えば、複数のホスホチロシン部位の検出)では、ステップ2.5〜2.9を繰り返します。
3. 画像取得
>注:単一分子の画像取得は、150x TIRF対物レンズと、emCCDカメラの特定の象限の各スペクトルチャネルをキャプチャする画像スプリッターを使用して実行されます(材料の表を参照)。キャリブレーション画像は、最初に、3 ± 1 μm(合計サイズ~60μm×60μm)の穴内距離で20 x 20の20±50nmの穴の20 x 20アレイを含むナノパターンチャネルアライメントグリッド(ナノグリッド)を使用して、チャネル登録とカメラゲインキャリブレーションを可能にするために取得されます。
- 以下の手順に従ってチャンネル登録を行います.
手記：エミッタの共局在を適切に計算するには、正確なチャンネル登録が必要です。この手順は重要です。
- オイル対物レンズを清掃し、対物レンズにオイルを一滴堆積させます。ナノグリッドをステージ上に置き、イメージングします。透過白色光を使用して、グリッドパターンに焦点を合わせます.
手記：ナノグリッドを使用した画像は、ナノグリッドを通過してすべてのスペクトルチャネルで検出される透過光を使用して取得されます。あるいは、各チャネルで検出された蛍光を放出するマルチ蛍光ビーズを使用することもできます。画像取得は、各顕微鏡のセットアップに応じて最適化する必要があります。
- グリッドの一連の 20 枚の画像を取得します。ピクセルが飽和していないことを確認します。画像シリーズを「Fiducial」として保存します。
- ナノグリッドの焦点をぼかして、エアリーパターンを作成します。ゲインキャリブレーションのために一連の20枚の画像を取得します。画像を「ゲイン」として保存します。
- カメラに向かうすべての光を遮断することにより、カメラオフセット用の一連の20枚の画像を取得します。画像を「背景」として保存します。
- SiMPull画像の取得.
手記：カバースリップアレイをイメージングする前に、Tris溶液をT50-BSAに交換し、アレイをRTに平衡化します。
- オイル対物レンズを清掃し、対物レンズに追加のオイルを堆積させます。カバースリップアレイを顕微鏡ステージに固定します。
- 各蛍光色素の励起電力、TIRF角度、カメラ積分時間を最適化します。目標は、サンプルの光退色を最小限に抑えながら、最高のS/N比を達成することです。将来の測定で一貫性を保つためにレーザー出力を記録します.
手記：本研究では、遠赤チャネルに300ms、緑チャネルに1秒の露光時間を使用しました。642 nmレーザーは約500 μWのレーザー出力で使用され、488 nmレーザーは860 μWで使用され、真空管レンズの前で測定されました。
- サンプルごとに画像を取得します。最初に遠赤チャネルを画像化し、次に各低波長の蛍光色素分子を画像化して、光退色を低減します。各サンプルに使用される量が少ないため、30〜45分ごとにバッファーレベルを確認し、必要に応じて補充してください。