Planar Supported Lipid Bilayer Assay:生体膜模倣体上のセプチンアセンブリを調査するための顕微鏡ベースのIn Vitro技術

要約

出典:Curtis, B. N. et al.生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成。J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオでは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、in vitroでガラス支持脂質二重膜上のセプチン組織を調査する手順を示します。

プロトコル

1. 平面脂質二重膜

1. スライドのプラズマクリーニング<br /> 手記：プラズマ洗浄は、有機汚染物質を除去し、ガラスの親水性を高め、効率的な脂質吸着を保証します。次の手順は、使用するプラズマクリーナーとガラスカバースリップに応じて変更または最適化が必要になる場合があります。
   1. プラズマクリーナーを酸素で5分間パージして、ラインとチャンバーから空気を取り除きます。これは、プラズマクリーナーを運転するときに、ラインとチャンバーに主に酸素が存在することを確認し、より一貫した二重層調製を提供するためです。
   2. パージ中に、N₂やArなどの不活性ガスをマイクロカバースライドに流して、ほこりや微粒子を取り除きます
      随意：カバーガラススライドは、片面に100%イソプロパノールをスプレーし、続いて水を噴霧することで洗浄できます。イソプロパノール - 水洗を3回繰り返し、次にN₂ストリームで乾燥させます。
   3. ドライカバーのスライドガラスをセラミックのクレードルに配置します。カバーガラスがチャンバーの長辺と平行になるように、プラズマチャンバーの背面にクレードルを配置します(これにより、プラズマクリーニング中にカバーガラスが所定の位置に保持されます)。プラズマクリーナーを最大出力で酸素状態で15分間運転します。
2. チャンバー調製
   手記：ここで説明する方法は、プラスチック製のPCRチューブからの自家製チャンバーを使用して反応量をサポートしますが、シリコーンウェルなどの他の低接着材料も適している場合があります。
   1. カミソリの刃またはハサミを使用して、0.2 mL PCRチューブのつや消し部分のすぐ下のキャップを切り取ります(図1)。
   2. PCRチューブの縁をUV活性化接着剤で塗装し、チューブの内側を避けます。PCRチューブをグルーダウンして、プラズマ洗浄したカバースリップの中央にそっと置きます
      手記： チャンバー内の接着剤を避けるために、最小限の接着剤を使用してシールを取得し、チャンバーをぶつけたり乱したりすることなく、すぐにUVで処理します。
   3. チャンバーを長波長のUV光の下に5〜7分間置き、接着剤を硬化させます。
3. 二層形成
   手記：このステップでは、効率的な二重層形成のために単分散SUVを使用する必要があります。表1は、ストックおよび最終バッファー濃度を含む、二重層形成に使用されるすべてのバッファーのレシピを示しています。
   1. 40 μL の担持脂質二重層バッファー (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl₂;表1)、5mM SUVの10μL、および100mM CaCl₂の1μLをウェルに注入した。チャンバーを左右に静かに振ってSUVを乱し、37°Cで20分間インキュベートします
      手記： 蒸発を制限するために、蓋をしたペトリ皿でウェットワイプでインキュベートします。
4. 余分な脂質を洗い流す<br /> 手記：このステップでは、余分な SUV が除去され、バッファー交換ステップとして機能します。洗浄中にピペットチップで二重層をこすり落とさないようにすることが非常に重要です。ガラスが露出すると、セプチンや他の多くのタンパク質が不可逆的に結合し、有効なタンパク質濃度が低下します。
   1. インキュベーション後、150 μLのSLBBで二重層を6回すすぎ、気泡を避けながらピペッティングで上下に繰り返して混合します><。 注:すでに存在する50 μLのバッファーとSUVに150 μLを直接加えると、反応ウェルに合計200 μL
   が入ります。
   2. セプチンまたは選択した別のタンパク質とのインキュベートを開始する準備ができたら、150 μLの反応バッファー(RXN:33.3 mM KCl、50 mM HEPES、pH 7.4、1.4 mg/mL BSA、0.14%メチルセルロース、1 mM BME)で二重層を6回洗浄します
      注:最良の結果を得るには、反応バッファーを新鮮にし、反応ウェルを混合する際には、気泡を避けるために細心の注意を払ってください。
   3. 最後の洗浄ステップで、125 μLの反応バッファーを取り出し、ウェルに75 μLを残します。セプチン保存バッファー(SSB:300 mM KCl、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM BME)で希釈したセプチン25 μLを所望の濃度で加え、TIRF顕微鏡で画像化します><。 手記：このアッセイを初めてセットアップする場合、または新しい脂質組成を組み込む場合は、光退色後の蛍光回収(FRAP)を使用して、脂質が表面上に自由に拡散していることを確認することをお勧めします。回収率は脂質組成によって異なり、自立型システムよりも本質的に低くなりますが、脂質が動かないべきではありません。

>表1:支持脂質二重膜および反応の調製のための緩衝成分。 バッファーに取り込まれるストック溶液の量と、各成分の最終濃度が示されています。SLBとPRBは室温で保存でき、実験間で再利用できます。反応バッファーとSSBは、実験ごとに新鮮に作られています。

の の の の

サポートされている脂質二重層バッファー(SLBB)
株式	容積	最終濃度
2 M KCl	1.5ミリリットル	300 mM
1 M HEPES	200μL	20 mM
500 mM MgCl2	20μL	1 mM
水	8ミリリットル
反応前バッファー(PRB)
株式	容積	最終濃度
2 M KCl	166μL	33.3メートル
1 M HEPES	500μL	50 mM
水	9.33ミリリットル
反応バッファ
株式	容積	最終濃度
2 M KCl	166μL	33.3メートル
1 M HEPES	300μL	50 mM
10 mg / mL BSAの	1.39ミリリットル	1.39 mg/mL
1%メチルセルロース	1.39ミリリットル	0.0014
水	10mLまで
BMEの	0.7μL	1 mM
>セプチンストレージバッファ(SSB)
株式	容積	最終濃度
2 M KCl	1.5ミリリットル	300 mM
1 M HEPES	500μL	50 mM
水	10mLまで
BMEの	0.7μL	1 mM

結果

図1:反応チャンバーのセットアップの概略図。カスタムチャンバーを調製するには、0.2 mL PCR チューブを、チューブが漸減し始める場所とキャップ (赤い破線) で切断します。次に、カットされたチューブの未カットの縁をUV活性化接着剤(青)の薄層でコーティングし、カバースリップに接着剤を塗ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 mL PCRチューブ、フラットキャップ付き、ナチュラル	ワトソン	137-211C(特)
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-1KGさん
塩化マグネシウム	VWRの	7791*18*6
メチルセルロース4000cp	シグマ・アルドリッチ	M052-100G
平面二重膜用のマイクロガラスカバースリップ	松波	中止	22×22
光学接着剤	ノーランド・ソーラブ	NOAの68	ガラスまたはプラスチック用の柔軟な接着剤
プラズマクリーナー	プラズマエッチング	PE-25	電圧:120V、60Hz、電流:15アンペア
塩化カリウム	VWRの	0395-1キロ
UVランプ	スペクトロライン	ENF-260Cの	115 ボルト、60 Hz、0.20 アンペア
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A4612-25Gの
ベータメルカプトエタノール(BME)	シグマ・アルドリッチ	M6250-100ミリリットル
DOPCの	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	850375
エッグリスローダミンPE	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	810146