球状担持脂質二重層アッセイ:ミクロスフェア上のセプチンアセンブリを観察する技術

要約

出典: Curtis, B. N. et al., Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、脂質二重層でコーティングされたミクロスフェア上のセプチンタンパク質の集合を研究する技術について説明しています。この手法は、曲面上のタンパク質の曲率依存性集合を理解するのに役立ちます。

プロトコル

1. 球状担持脂質二重膜

>注:このプロトコルは、10%の密度で超純水に懸濁されたシリカ微小球を使用します。タンパク質集合の速度論的パラメータに関するいかなる研究においても、実験と曲率の間の全膜表面積を厳密に制御することが重要です。表1は、全膜表面積の5 mm²を維持するためのビーズとバッファーの補正された体積を示しています。

1. 二層形成
   手記：平面二重膜に関しては、堅牢な二重層形成のために高品質のSUVを用意することが重要です。表1は、10%密度溶液からのビーズの体積と、さまざまなビーズ直径で5 mm²の最終表面積を得るために使用されるそれぞれのSLBB体積を示しています。
   1. シリカ微小球(ビーズとも呼ばれる)は、沈殿して凝集する傾向がある;ビーズを混合して任意のクラスターを分裂させるには、ボトルを15秒間ボルテックスし、次いで1分間入浴超音波処理し、再び15秒間ボルテックスする。
   2. 0.5 mLの低接着マイクロ遠心チューブで、適切な量のビーズ(表1)と対応する容量のSLBBおよび10 μLの5 mM SUVを混合します。
   3. ビーズ-脂質混合物を室温で1時間、端から端まで揺さぶる。沈降を防ぐために、このインキュベーションがローテーターで行われることを確認してください。
2. PEG化カバースリップにチャンバーを準備します
   手記：平面二重膜に関しては、プラスチック製のPCRチューブからの自家製チャンバーを使用して反応量をサポートしますが、シリコーンウェルなどの他の低接着材料も同様に機能する可能性があります。
   1. ビーズが揺れている間に、PEG化カバーガラスを室温で解凍します。0.2 mL PCR チューブをカットし、説明に従ってカバーガラスに接着します。24 mm x 50 mmのスライドの場合、1つのスライドに最大10個のチャンバーを収めることができます><。 手記：このプロトコルでは、事前に準備された24 mm x 50 mmのPEG化ガラスカバースリップを使用します。簡単に説明すると、ガラスカバースリップは、アセトン、メタノール、および3 M KOHでの超音波処理によって徹底的に洗浄されます。次に、カバーガラスをn-2-アミノエチル-3-アミノプロピルトリメトキシシランで官能基化し、mPEGスクシンイミジル吉草酸エスプレレートに共有結合します。完成したPEG化カバースリップは、-80°Cで真空シールして保管されます。ここではPEG化ガラスカバースリップが推奨されていますが、BSAやポリ-L-リジン法などの他の不動態化手段が効果的である可能性があります。
3. 余分な脂質を洗い流す
   手記：このステップは、余分なSUVを取り外し、バッファ交換を実行するように機能します。ビーズは、プレリアクションバッファー(PRB:33.3 mM KCl、50 mM HEPES、pH 7.4)で合計4回洗浄します。表2に、さまざまなビーズ直径のRCFでのスピン速度を示します。
   1. 指定されたRCFでビーズを30秒間スピンします(表2)。複数のビーズサイズを使用する場合は、ビーズを洗う時が来るまでビーズを揺らし続けます.
      手記：時間を節約するために、大きなビーズを小さなビーズと同じスピンで沈降させ、ビーズの沈降速度を小さくする価値はありません。これにより、ビーズが互いにくっつき、二重層の完全性が損なわれる可能性があります。
   2. 最初のスピン後、50 μLの上清を除去し、200 μLのPRBを加えます。2回目と3回目のスピン後、200μLを取り出し、200μLのPRBを添加します。4回目のスピン後、200μLを取り出し、220μLのPRBを加えます。洗濯のたびに勢いよくピペットを振る
      手記：最終的な再懸濁液の量は、洗浄量とは異なります。脂質とのインキュベーション後にビーズをボルテックスすると、二重層に隙間ができる可能性があるため、ボルテックスしないでください。他のビーズサイズでの作業中やアッセイの他の部分のセットアップ中に沈降を避けるために、ビーズ混合物をエンドオーバーエンドローテーターに戻します。
4. 反応の準備
   1. 複数のビーズサイズで競合アッセイを行う場合は、各ビーズサイズを等量混合して1:1の混合物を作成します。次に、29 μLの所望のビーズ混合物(または1つのビーズ)を721 μLのRXNバッファーと混合します
      手記：ビーズの密集を避けるために、各ステップでビーズをピペットで完全に混合することが重要です。これにより、ビードの分布がより均一になり、総表面積が正確になります。
   2. 希釈したビーズ75μLとSSBで希釈したタンパク質25μLをウェルに混合します
      手記：著者らは通常、1〜50 nMの酵母セプチン複合体を画像化します。
   3. 定常状態でセプチンを測定する場合は、室温で1時間インキュベートした後、近TIRF顕微鏡または共焦点顕微鏡でイメージングします
      手記：この反応は、反応の全膜表面積を5 mm²に保持し、100 mM KCl、50 mM HEPES、1 mg/mL BSA、0.1%メチルセルロース、および1 mM BMEの最終反応条件を生成するように設計されています。

表 1: マイクロスフェアの正規化された体積。各ビーズ サイズの表面積を等しく維持し、実験間で膜全体の表面積を一定に保つために、各ビーズ サイズの体積と、総表面積を正規化したバッファーを計算しました。

名 日 名 名 名 % 名 % 名 % 名 名

ビード径(μm)	よく混合されたビーズの容量(μL)	SLBバッファー容量(μL)	SUVの容積(μL)
6.46	8.94%	61.1	10
5月06	7	63	10
3.17	4.39	65.6	10
0.96	1.33	68.7	10
0.54	0.75	69.3	10
0.31	0.43	69.6	10

表 2: さまざまな直径の微小球の沈降速度。各ビーズの直径について、示された最小沈降速度を使用してビーズをペレット化し、未結合のリポソームを洗い流しました

日

ビード径(μm)	沈降速度(RCF)
0.31	4.5
0.54	4.5
0.96	2.3
3.17	0.8
5月06	0.3

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 mL PCRチューブ、フラットキャップ付き、ナチュラル	ワトソン	137-211C(特)
0.5 mL 低接着チューブ	USAサイエンティフィック	1405-2600
ベータメルカプトエタノール(BME)	シグマ・アルドリッチ	M6250-100ミリリットル
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A4612-25Gの
PEG化カバースリップを作るためのカバーガラス	サーモサイエンティフィック	152450	リチャード・アラン・サイエンティフィック SLIP-RITE カバー ガラス 24x50 #1.5
DOPCの	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	850375
エッグリスローダミンPE	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	810146
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-1KGさん
メチルセルロース4000cp	シグマ・アルドリッチ	M052-100G
ミニ遠心分離機
非官能化シリカミクロスフェア	バングスラボラトリーズ株式会社	サイズによって異なります:SS0200 *-SS0500 *	水性懸濁液中のシリカ
光学接着剤	ノーランド・ソーラブ	NOAの68	ガラスまたはプラスチック用の柔軟な接着剤
塩化カリウム	VWRの	0395-1キロ
ソニケーターバス	ブランソン	1510R - MT	Bransonic 超音波洗浄機。50-60 Hz. 出力: 70W
大豆PI	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	840044
卓上遠心分離機	エッペンドルフ	22331
UVランプ	スペクトロライン	ENF-260Cの	115 ボルト、60 Hz、0.20 アンペア

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