alamarBlue Assay:人工涙液製剤がヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす細胞毒性効果をスクリーニングするための高感度蛍光測定法

要約

出典:Rangarajan, R. et al.乾燥への曝露後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に対する人工涙液製剤の影響。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、レサズリンベースのアラマーブルー溶液を使用して、角膜上皮細胞の細胞代謝活性に対する人工涙液製剤の影響を評価するためのin vitro蛍光測定アッセイについて説明しています。無毒の製剤は、細胞を健康で代謝活性な状態に維持し、レサズリンを高蛍光のレゾルフィンに還元するのを促進します。

プロトコル

1. ヒト角膜上皮細胞培養

1. 不死化HCECをコラーゲンコーティングした75 cm²フラスコに、10%のウシ胎児血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含む20 mLのダルベッコ修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)を37°C、5%CO₂.
   で増殖させます 注:振る必要はありません。
2. メディアは2〜3日ごとに交換してください。

2. テスト用の細胞の準備

1. 細胞がほぼコンフルエントになったら、培地を取り出します。
2. 4-6 mLの細胞解離溶液を各75 cm²フラスコに加えます。細胞が剥離するまで(約20〜30分)、定期的に顕微鏡でチェックしながら、細胞を37°Cでインキュベー
トします。
3. 10%FBSを含むDMEM/F12を75 cm²の各フラスコに2-6 mL加えます。
4. フラスコの内容物を50mLの遠心分離チューブに移します。
5. 細胞を450-500 x gで5分間遠心分離し、上清をピペットで取り出し、細胞を予熱培地に再懸濁します。
6. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。合計 1 x 10⁵ セルを含むメディアの体積を計算します。
7. 1 x 10⁵細胞を48ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに加えます。ウェル内の培地の最終容量が 0.5 mL の培養 DMEM/F12 と 10% FBS.
   になるように、ウェルに十分な培地を追加します 注:人工涙液製剤は、HCECの代謝活性の低下によって測定できる細胞毒性を引き起こす可能性があります。データの一貫性は、播種時に各ウェルに同じ数のHCECを追加することに依存します。48ウェルプレートに推奨される培養濃度は1 x 10⁵です。哺乳類細胞は再懸濁後に遠心分離管に沈殿する可能性があるため、細胞懸濁液がHCECを均等に分布するようにプレートに細胞を播種しながら、頻繁に攪拌して細胞を再懸濁することをお勧めします。
8. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で24時間インキュベートします。

3. 乾燥プロトコルなし

1. 制御手順
   1. 24時間のインキュベーション後、培地をプレートから取り出します。
   2. 直ちに150 μLの試験製剤と培地制御溶液で処理してください。
   3. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で30分間インキュベートします。
   4. セルから試験液を取り出します。
   5. 代謝活性をテストするために、0.5 mLの10%代謝染料溶液を加えます。.細胞を37°Cおよび5%CO₂でさらに4時間インキュベートします。
   6. 4時間のインキュベーション期間後、各ウェルから100 μLの代謝色素溶液を取り出し、各100 μLを96ウェルプレートのウェルに入れます。
   7. 蛍光プレートリーダーを使用して各ウェルの蛍光を測定します(材料表)。励起波長を540nm、発光波長を590nmに設定します。
2. 乾燥プロトコルなし(回復手順)
   1. 手順3.1.1−3.1.4を繰り返します。
   2. 各ウェルに0.5 mLのDMEM/F12培地を添加します。
   3. 1セットの培養物を37°Cおよび5%CO₂で18時間インキュベートします。
   4. 培地を取り出し、0.5mLの10%代謝染料溶液を加えます。手順 3.1.6 と 3.1.7 を繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	共演	3370
alamarブルー	フィッシャーサイエンティフィック	ダル1025
Corning 48ウェルプレート	コーニング	354505	これはBioCoatブランドのコラーゲンコーティングです
DMEM/F12 と L-グルタミンおよび 15 mM HEPES	ギブコ	〒11039-021	このメディアにはフェノールレッドは含まれていません
ウシ胎児血清	ヒコーン	03 SH30396
ヒト角膜上皮細胞	オタワ大学	該当なし	M. Griffith博士(オタワ眼研究所、オタワ、カナダ)のSV40不死化ヒト角膜上皮細胞は、Griffith M、Osborne R、Munger R、Xiong X、Doillon CJ、Laycock NL、Hakim M、Song Y、Watsky MAによって特徴付けられています。細胞株から構築された機能的なヒト角膜同等物。科学。1999;286:2169–72。
TrypLE Express(細胞解離溶液)	フィッシャーサイエンティフィック	12605036
サイト5	ビオテック	CYT5MPV	280 - 700 nmの蛍光を読み取ることができます(アッセイ540/590用)