$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>注:この研究で使用された組換えタンパク質、Hsp90、およびCdc37は、商業的に入手されました(材料の表を参照)。
1. チップのアクティベーション
>注:実験で使用するすべての材料は、材料の表に記載されています。調製したすべての溶液を滅菌済みの0.2μmフィルターでろ過します。
- 15 mLチューブ中の1 M 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH = 6.0)2.5 mLに2 mgのEDCを加えて、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)溶液を調製します。N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ-NHS)溶液を調製するには、別の15 mLチューブに2.5 mLの1 M MES緩衝液(pH = 6.0)に6 mgのスルホ-NHSを加えます。各溶液50 μLを独立したチューブに入れて分注し、将来の使用に備えて-20°Cで保存します。
- 等量のEDCとsulfo-NHS溶液(50 μL + 50 μL of sulfo-NHS)をピペッティングで上下に混合します(ボルテックスしないでください)
注: EDC/sulfo-NHSの混合溶液は、適切なチップ機能化のために効果的な架橋を維持するために30分以内に使用する必要があります。
- 同社から提供されたバイオセンサーチップ(5.7 cm x 2.4 cm、材料の表を参照)を、蓋を取り付けたガラスのペトリ皿に入れます。チップの活性化に関与するすべての官能基化ステップは、ペトリ皿内で行うことが推奨されています。1 M MESバッファー(pH = 6.0)50 μLをバイオセンサーチップにインプし、室温で1分間インキュベートした後、バッファーを吸引します。
- 50 μLのEDC/sulfo-NHS溶液を直ちにセンサーチップに塗布します。ペトリ皿に蓋をして、室温で15分間インキュベートします。チップからEDC/sulfo-NHS溶液を吸引します。
- チップを50 μLの1 M MESバッファー(pH = 6.0)で1回すすぎ、MESバッファーを吸引します。
2. 標的タンパク質の固定化
- チップを50μLの1x PBS(pH = 7.4)で2回すすぎます。チップからPBSを吸引し、標的分子Hsp90(50μL;500nM).
を添加します。
注:バッファの不一致は、実験全体を台無しにする可能性があります。したがって、実験の前に、標的分子がキャリブレーションに使用したバッファーと同じバッファー(1x PBS(pH = 7.4)など)にあることを確認することが重要です。必要に応じて、実験前に一晩透析によるバッファー交換を行います。この実験では、組換えタンパク質Hsp90とCdc37の両方について、1x PBS(pH = 7.4;材料表を参照)に対して、4°Cで適切なバッファー交換を行い、一晩透析を行いました。標的物質(この場合はHsp90)の濃度は、異なる実験プロトコルおよび標的物質(タンパク質/ペプチド/リガンド)の性質によって異なる場合があります。
- ガラスのペトリ皿に蓋をし、室温で30分間インキュベートします。標的分子を含む溶液を吸引し、1x PBS (pH = 7.4) の 50 μL で 3 回すすぎます。チップから1x PBS(pH = 7.4)溶液を吸引します。
- 50 μL の Quench 1 (3.9 mM アミノ-PEG5-アルコール、1x PBS (pH = 7.4)) 溶液をチップに加え、ガラスのシャーレを覆い、室温で 15 分間インキュベートします。チップからQuench 1溶液を吸引します。
- 50 μLのQuench 2 (1 Mエタノールアミン(pH = 8.5))溶液をチップに加えます。ガラスのペトリ皿に蓋をし、室温で15分間インキュベートします。チップからクエンチ2溶液を吸引し、50μLの1x PBSを使用してチップを5回すすぎ、最後のPBS液滴をセンサーに残します。
3. 分析物サンプルの準備
- Cdc37 の一連の分析種希釈を、目的の濃度範囲で調製します。最初の実験では、25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、800 nM、1,000 nM、2,000 nM、3,000 nM、5,000 nMの濃度を使用しました。2 番目の実験では、0.4 nM から 200 nM の範囲の異なる濃度のセットを使用しました。
- 信頼性の高いKD値を得るために、少なくとも8つの異なる分析種濃度を含むように実験を設計します。キャリブレーションおよび標的タンパク質に使用したバッファーと同じバッファーで、分析種タンパク質の異なる希釈液を調製します。ここでは、1x PBS(pH = 7.4)です。
4. 活性化したバイオセンサーチップのFEBデバイスへのロード
>注:FEBデバイスは、LEDライト表示を備えたリーダーとバイオセンサーチップを挿入するためのカートリッジで構成されています。
- 標的タンパク質を固定化した後、活性化したチップをデバイスのカートリッジに挿入し、USB経由でコンピューターに接続します。チップの挿入後、FEBデバイスが実験の準備ができていることを示す緑色のLEDライトがリーダーに表示されます。FEB装置が接続されているコンピュータに、会社が提供する自動ソフトウェア(資料表参照)をインストールし、以下の通り、実験を段階的に監視してください。
5. 実験を実行します
- 自動化されたソフトウェアのRun Experimentモジュールを押して、10 Points with Regenerationまたはその他の任意のプロトコルを選択します。オペレーター名、実験名、日付(例:Yana、Hsp90 + Cdc37、2021年3月14日)再生バッファ(例えば、PBSバッファ);固定化されたターゲット(例:Hsp90);溶液中の分析物(例:Cdc37)。
- ソフトウェアに表示されているBegin the Experimentボタンを押し、自動化ソフトウェアが示す以下の指示に従います。
手記：このソフトウェアは完全に自動化されており、ユーザーフレンドリーで、実験全体を通してユーザーを段階的にガイドします。ポップアップウィンドウが画面に表示され、実験の各ステップをさらに進めるように指示されます。このソフトウェアは、実験全体を通じて、各分析物濃度のキャリブレーション、分析種の関連付け、解離、再生、および洗浄(5x)から、各反復ステップの指示を連続して提供します。
- 機器のキャリブレーションを実行します。これを行うには、チップから残りのPBS溶液を吸引し、50 μLのキャリブレーションバッファー(1x PBS、pH = 7.4)を適用します。[続行]ボタンを押して、キャリブレーション手順が終了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、キャリブレーションステップ(5分)で決定されたエンドポイントを表示し、フォローアップするための警告アラームを表示します。
- 次に、分析物の関連付けを行います。これを行うには、チップからキャリブレーションバッファーを吸引し、最も低い分析種濃度の50μL(25 nMのCdc37)を適用します。[Continue] ボタンを押して、関連付け手順が終了するまで 5 分間待ちます。ソフトウェアは、関連付けステップ(5 分)のエンドポイントを表示し、続行するための警告アラームを表示します。
- 分析種の解離を行います。これを行うには、チップから分析種溶液を吸引し、解離バッファー (1x PBS、pH = 7.4) 50 μL を塗布します。Continue(続行)ボタンを押して、解離ステップの持続時間(5分)が終了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、解離ステップ(5分)のエンドポイントを表示し、フォローアップするための警告アラームを表示します。
- 次に、チップの再生成を行います。チップから解離溶液を吸引し、50 μLの再生バッファー(1x PBS、pH = 7.4)を塗布します。[続行] ボタンを押して、再生成ステップの持続時間 (30 秒) が終了するまで 30 秒待ちます。ソフトウェアは、再生成ステップ(30秒)のエンドポイントを表示し、フォローアップするための警告アラームを表示します。
- 最後にチップを洗います。チップから再生溶液を吸引し、50 μLの洗浄バッファー(1x PBS、pH = 7.4)をチップに適用します。チップから溶液を吸引し、これを5回繰り返します。最後の一滴のウォッシュバッファをチップに残し、Continueボタンを押して、ソフトウェアディスプレイでウォッシュステップの持続時間が終了するまで30秒間待ちます。
注:ソフトウェアは、洗浄ステップ(30秒)のエンドポイントを表示し、実験の次のサイクルに進むための警告アラームを表示します。
- 使用した分析種の濃度ごとにステップを繰り返し、キャリブレーション、分析種の関連付け、解離、再生、洗浄(5x)の5つのステップが1サイクルを構成します。ここに示す実験では、10の分析種濃度(25 nM〜5,000 nMまたは0.4 nM〜200 nMの範囲)に対して10サイクルを実行しました。図1)。
