抗原-抗体相互作用を単一分子レベルで研究するための質量測光

要約

出典: Wu, D. et al., Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry. J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、質量測光を使用してフローチャンバー内の抗原-抗体相互作用を研究する方法を示します。集束された光は、分子の質量に基づいて異なる方法で散乱します。検出器は散乱光を収集し、分子量と相関するさまざまな強度のスポットとして干渉パターンを生成します。

プロトコル

1. フローチャンバーを準備します

1. ガラスカバースリップを清掃します
   1. 蒸留水、エタノール、イソプロパノールを入れたウォッシュボトルを使用して、24 mm x 50 mmのカバースリップを水、エタノール、水、イソプロパノール、水の順にすすぎます。きれいな窒素の流れでカバースリップを乾かします。カバースリップを上から下にすすぎ、先端が柔らかい鉗子で下の角を保持することが重要です。鉗子からの汚染が移らないように、カバーガラスを同じ方向に乾かします(図1A)。
   2. 同様に、24 mm x 24 mmのカバースリップを蒸留水、エタノール、蒸留水ですすいでください。きれいな窒素の流れでカバースリップを乾かします。
   3. カバースリップの作業面を特定し、清潔なカバースリップの表面に蒸留水を一滴垂らし、プロトコールのステップ3.1〜3.2に従います。通常、24 mm x 50 mm のカバースリップの片面のみが MP 測定に適した光学品質を備えています。
      手記：フォーカシング後、表面の大きな欠陥は検出できず、データ収集ソフトウェアに表示される「信号」値は0.05%未満である必要があります(図2A-C)。ボックス内のすべてのカバースリップの作業面は同じ方向を向いています。カバースリップのクリーニングの効率をテストするためにも、同じ手順を使用する必要があります。
2. フローチャンバーを組み立てます
   1. 24 mm x 24 mm のカバースリップをアルミホイルの上に置きます。図 1B に示すように、24 mm x 24 mm のカバーガラスの上に両面テープのストリップを置き、ガラスの端に沿ってテープをカットします。カバーガラスをアルミホイルから分離し、24 mm x 50 mmのカバーガラスの作業面に取り付けます(図1C)
      手記：チャネル サイズは異なる場合がありますが、幅は 3 mm から 5 mm にすることをお勧めします。チャンネルの幅が広いと、より多くのサンプル量が必要になり、非常に狭いチャンネルはロードが難しくなる可能性があります。通常、24mm x 24mmのカバースリップに2つのパラレルチャンネルを簡単に作成できます。ここでプロトコルを一時停止できます。

2. アフィニティー測定用の抗体抗原サンプルを調製します

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1. 0.22 μmシリンジフィルターを使用して少なくとも2 mLのPBSバッファーをろ過し、粉塵粒子または凝集体を除去します。卓上遠心分離機の最高速度(約16,000 x g)でタンパク質ストックを10分間遠心分離します
   手記：PBSはこのプロトコルの推奨バッファーですが、MPには特定のバッファー要件はなく、他の生物学的バッファーも許容されます。ただし、グリセロール濃度が高い(>10%)、イオン強度が非常に低い(塩濃度<10 mM)と、画像とデータの品質に影響を与える可能性があるため、推奨されません。
2. 抗体および抗原ストックの実際の濃度は、280 nm UV吸光度を測定して測定します。
3. 抗原-抗体混合物の測定濃度を計算します。抗体結合親和性の推定値が不明な場合は、30 nM抗原と20 nM抗体濃度のサンプルを調製する計画を立ててください。おおよその親和性がわかっている場合は、抗体と抗原の比率とその濃度を、予想されるK_d値に従って最適化する必要があります。混合物中の総抗原濃度は、予想されるK_dと以下の式の総抗体濃度の合計に等しいものを使用してください。抗体の2つのパラトープについてK_d1 = K_d2と仮定すると、サンプル中の遊離抗体と抗体-抗原複合体の濃度は同等になります
   
   抗体濃度を調整して、サンプル中の総タンパク質濃度が10 nMから50 nMの範囲に収まるようにします。最良の結果は、抗体濃度が5 nM〜25 nMの混合物を使用して得られます
   手記：MPは、分子量が40 kDaを超えるタンパク質を検出します。その結果、分子量が40 kDa未満の抗原のサンプル濃度は、通常の50 nMの制限を超える可能性があります。しかし、約100 nMを超える濃度では、低分子量の抗原であっても、Kd測定の画質と精度に影響を与える可能性があります。
4. ステップ2.3で計算した最終測定濃度で、抗体-抗原混合物50μLを調製します。
   手記：抗原-抗体混合物のサンプルは1つだけで、_Kdの測定には必要ありません。しかし、抗原と抗体の比率が異なる複数のサンプルを調製することで、サンプル濃度を最適化することができます。複数のサンプルからデータを収集した場合、グローバルフィットを介して分析できます。
5. 抗原-抗体混合物を室温で約10分間インキュベートし、結合反応が化学平衡に達するまで待ちます。不必要に長いインキュベーション時間を避けてください.
   手記：インキュベーション時間は、結合速度によって異なります。化学平衡に達したことを確認するために、サンプル測定を異なるインキュベーション時間で繰り返すことができます。時間不変のKD_値は、十分に長いインキュベーションを示します。インキュベーションが長引くと、プラスチックラボウェアの表面にタンパク質が著しく吸着し、その結果、タンパク質濃度測定に重大なエラーが生じる可能性があります。このため、MPサンプルの調製には低接着性のラボウェアを強く推奨します。

3. 質量測光データを収集する

1. MP装置対物レンズに顕微鏡浸漬オイルを一滴垂らし、組み立てたフローチャンバーを顕微鏡ステージに置きます。オイルがカバースリップと対物レンズの間の隙間に広がっていることを確認してください。
2. フローチャンバーをロードし、質量光度計に焦点を合わせます。
   1. ステップ1で調製したフローチャンバーチャネルの一端に、清浄でろ過された緩衝液10 μLを沈殿させます。液体は毛細管現象によってチャネルに入ります。
   2. ステージのZ位置を調整して、顕微鏡を24 x 50 mmカバースリップの作業面に焦点を合わせます。
      1. データ収集ソフトウェアの[フォーカスコントロール]タブで、粗いステージ移動の[上]ボタンと[下]ボタンを使用して初期調整を行います。
      2. [シャープネス]ボタンをクリックしてシャープネス信号の読み出しを表示し、細かいアップおよびダウン調整ボタンを使用してシャープネス値を最大化します。
      3. [フォーカスの設定]ボタンと[フォーカスのロック]ボタンをクリックして、フォーカストラッキング機能をアクティブにします。適切にピントが合った画像(図2A、C)の「信号」値は0.05%未満である必要があります
         手記：最大シャープネス位置の「信号」値が0.05%を超える場合は、ガラス表面またはバッファー内の不純物を示している可能性があります。
3. 同じチャネルを使用して、抗体抗原サンプルをチャネルの片側に沈着させ、もう一方の端から液体を小さな吸い取り紙でブロッティングすることにより、20 μLをロードします(図1D).
   手記：幅3〜5 mmのチャンネルの容量は約10 μLです。チャネルに存在するバッファーを完全に交換し、サンプルの希釈を避けるために、追加のサンプル量が推奨されます。
4. サンプルをロードしたら、すぐに[Record]ボタンをクリックしてデータ収集を開始し、100秒のビデオを取得します(図2D)。
5. データ コレクションの最後にファイル名を入力し、[OK] をクリックしてデータ ファイルを保存します。
6. カバースリップを廃棄し、イソプロパノールで濡らした綿棒で対物レンズから油を拭き取ります.
   手記：ここでプロトコルを一時停止できます。

4. MPデータを解析する

1. 収集したビデオファイルをMPデータ処理ソフトウェアで処理し、ランディングイベントを特定します。
   1. 「ファイル」/「開く」メニュー・オプションを使用して、分析用のファイルをロードし、「分析」をクリックします。
   2. Loadボタンをクリックしてキャリブレーション機能をロードし、File/Save Results Asメニューオプションを使用して分析データを保存します。
2. 分子量分布をガウス関数で適合させ、サンプル中の各種の相対濃度を取得します。この分析は、一般的な科学グラフ作成ソフトウェア(材料表を参照)を使用して実行できます。
   1. 「eventsFitted.csv」ファイルをソフトウェアにインポートし、Plot/Statistics/Histogram関数を使用して分子量分布(.csvファイルの列M)をプロットします。
   2. ヒストグラムをダブルクリックして、プロットプロパティウィンドウを開きます。自動ビニングを無効にし、ビン サイズとして 2.5 kDa を選択します。「適用」ボタンと「移動」ボタンをクリックして、ビンの中心とカウントのデータを作成します。
   3. 「ビンの中心」列と「カウント」列を選択し、「解析/ピーク」および「ベースライン/マルチプルピークフィット」メニュー機能を使用して、ヒストグラムをガウス関数でフィットさせます。ダブルクリックして分布プロット上のおおよそのピーク位置を示し、[NLFitを開く]ボタンをクリックします。
   4. 「xc」ピークセンターの「Fixed」チェックボックスをオンにし、その値を遊離抗体およびシングルおよびダブル抗原抗体複合体の予想分子量に設定します。幅パラメータの [共有] オプションをオンにします。[フィット]ボタンをクリックします。ガウス成分の適合ピーク高さ値は、サンプル中の各種の相対濃度を表します。
      手記：ビンサイズは、質量分布プロットの解像度を最適化するために調整できます。MP の精度制限は約 1 kDa であり、ビン サイズが小さいと、分布のノイズが増幅される可能性がありますが、追加情報は公開されません。ビンのサイズが非常に大きいと、質量分布の細部が不明瞭になります。
3. 次の式を使用して、各種の濃度分率を計算します:
   
   ここで、H_IおよびF_Iの値は、サンプル中の遊離抗体およびシングル結合抗体およびダブル結合抗体のピーク高さおよび濃度画分をそれぞれ表します。

結果

図1:MPフローチャンバーの準備とローディング (A)洗浄手順のためのカバースリップ保持位置。(B)アルミホイルの表面(下層、図示せず)に24×24mmのカバーガラス(中間層)と両面テープ(最上層)を位置合わせした状態。青い破線は、切断線の位置を示しています。(C)2つのサンプルチャネルを備えた組み立てられたフローチャンバーの上面図と側面図、および組み立てられたフローチャンバーの写真。(D)以前にバッファーで満たされた流路にサンプルをロードする手順。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクワイアMP	レファイン		MPデータ収集ソフトウェア
反ヒトトロンビン	血液学技術	AHT-5020	RRIDの番号: AB_2864302
綿チップのアプリケーター	ソーラブ	CTA10	レンズクリーニング用の綿棒
カバースリップ 24x24 mm	グローブサイエンティフィック	1405-10
カバースリップ 24x50 mm	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-EPの
ディスカバーMP	レファイン		MPデータ処理ソフトウェア
鉗子	電子顕微鏡科学	78080-CFの	カバースリップの取り扱いに適したソフトチップ鉗子
ヒトαトロンビン	血液学技術	HCT-0020
浸漬油	ソーラブ	モイル-30
イソプロパノール	アルファ・アエサル	36644さん
マイクロソフトエクセル	マイクロソフト		スプレッドシート
ワンMP	レファイン		質量測光装置
元	オリジンラボ		科学グラフ作成ソフトウェア
PBSの	コーニング	46から013センチメートル	10xストック
シリンジフィルター	ミリポア	SLGSR33SS	バッファーとサンプルのフィルタリング

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