生きた細菌におけるタンパク質間相互作用の特性評価のためのFLIM-FRETイメージング

要約

出典: Manko, H. et al., FLIM-FRETによる生菌のタンパク質間相互作用の測定. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、蛍光タンパク質、ドナーeGFP、およびアクセプターmCherryで標識された細胞質タンパク質を発現する生きた細菌のタンパク質間相互作用を決定するためのFLIM-FRETイメージング技術について説明しています。また、この組み合わせ技術により、相互作用するタンパク質の定量も可能になります。

プロトコル

1. アガロースパッドの調製(図1)

1. 顕微鏡のスライドガラスを平らな水平面に置きます。最初のスライドの両側に2層の粘着テープを上にした2枚のスライドガラスを配置します
   手記：3つの整列したスライドの間に1〜2mmのスペースを空けて、溶けたアガロースが最終的に粘着テープでスライド上に広がるのを防ぎます。
2. ピペットでピペットを動かし、1%溶融したアガロース70μLの液滴をスライドガラスに注ぎます。上部に4番目のスライドを追加してアガロースの液滴を平らにし、軽く押し下げます。しばらくお待ちください。
3. 上部のスライドを取り外し、ピペットで約3μLの細菌をアガロースパッド上の異なる場所の3〜4つのスポットに落とします。
4. 顕微鏡ガラスカバースリップで覆います(例:ample、22x22 mm #1.5厚さ).
   手記： カバースリップの平坦度と厚さは、2光子励起を扱うために重要です。通常、均一な平坦度を制御し、自家蛍光を低く抑えた精密なカバーガラスが適しています。
5. カバーガラスを溶かしたパラフィンで固定し、スライドガラスにカバーガラスを密封します。カバーガラスの四隅を固定することから始めます。

2. 2光子顕微鏡によるイメージング

>注:私たちは、60x 1.2NAの水浸対物レンズを備えた自家製の2光子励起走査型倒立顕微鏡を使用しています。2光子励起波長は930nmに設定されています。これは、10〜20mWで動作するTi:Sapphireレーザー(80MHzの繰り返し周波数、≈70fsのパルス幅)によって提供されます。蛍光光子は、680 nmのショートパスフィルターと525/50 nmのバンドパスフィルターを介して収集され、その後、時間相関単一光子計数(TCSPC)モジュールに接続されたファイバー結合アバランシェフォトダイオードに送られました。顕微鏡には透過型蛍光ランプも装備されています。現在、いくつかのFLIM-FRET顕微鏡が市販されており、多くのイメージング施設にはFLIM-FRET測定を行うことができるセットアップが装備されています。

1. 蛍光ランプを使用して、サンプル中の細菌の単層に対物レンズを合わせ、関心領域を選択します。
2. 励起レーザーシャッターが閉じていること、レーザーからの赤外線が遮られて顕微鏡に入らないことを確認してください
   注意：レーザー光は目で見ることができないが、一時的な直接の露出やレーザー反射でさえ非常に有害であり、不可逆的な眼の損傷を引き起こす可能性があるため、IRパルスレーザーでの作業には細心の注意と絶え間ない警戒が必要です。顕微鏡セットアップを使用する前に、地域のレーザー安全手順とトレーニングを参照してください。
3. 顕微鏡スライドをステージに置き、カバーガラスを対物レンズに向けて
置きます。
4. 蛍光lを確認してくださいamp オンになっています。
5. フィルターキューブタレットを回してeGFPキューブを選択し、蛍光ランプシャッターを開きます。
6. 蛍光光を顕微鏡の接眼レンズに向けて送ります.
   注意:眼に損傷を与える可能性のある蛍光ランプからの直接励起光を排出するために、適切なフィルターが光路に廃棄されていることを確認してください。
7. 顕微鏡のつまみを使用して、対物レンズを細菌に焦点を合わせます。
8. モーター駆動ステージを制御するジョイスティックを使用してサンプルを平行移動することにより、サンプル内の関心領域を選択します
   手記：蛍光率の高いサンプルを使用すると、蛍光を目で直接観察できるため、ピント合わせが容易になります。
9. FLIM-FRET測定用の2PEレーザーの励起を切り替えます。
10. 蛍光発光経路を検出器に戻します。
11. フィルターキューブタレットを戻して、930nmレーザー用のダイクロイックキューブを選択します。
12. レーザー出力を20mWに設定します。
13. 対象領域のサイズを 30 μm に設定します。この操作は、ガルボミラーを動作させる電圧を調整し、ガルボミラーの動きの範囲を定義します(図2)。
14. 検出器の電源を入れてサンプルのスキャンを開始します-スキャンを制御する開始ボタンと停止ボタンは、安全上の理由とサンプルの光退色を制限するために、レーザーシャッターの開閉も制御します(図2)。
15. 必要に応じて、顕微鏡のファインフォーカスノブを少し動かしてピントを調整します。
16. イメージングの視野は、コンピュータインターフェースからステージを細かく動かして選択します。これは、画像の新しい中心を定義する顕微鏡制御ソフトウェア(図2)で画像上の十字を移動し、「ステージ移動」を押すことで、セットアップで実行できます。取得に適した視野は、10〜30個の動かないバクテリアの画像に対応し、すべて正しく焦点が合っています(すべてのバクテリアが同じ平面上にあります)。単一細胞FLIM-FRETデータの抽出に関心がある場合は、細菌が十分に個別化されていることを確認してください(画像のセグメンテーションがはるかに簡単になります)。

結果

図1.アガロースパッドの準備。

図 2.顕微鏡制御ソフトウェアのインターフェースの概略図

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
525/50nmバンドパスフィルター	F37-516、AHF、ドイツ
680nmショートパスフィルター	F37-516、AHF、ドイツ
アガロース	シグマ・アルドリッチ	A9539の
ファイバー結合アバランシェフォトダイオード	SPCM-AQR-14- FC、パーキンエルマー
ガラスカバースリップ(厚さNo.1.5、20×20mm	ニットガラス	MS0011
顕微鏡スライド(25×75mm)	ニットガラス	MS0057
TCSPCモジュール	SPC830, Becker & Hickl, ドイツ
Ti:サファイアレーザー	Insight DeepSee、スペクトル物理学

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