細胞接着分子間のトランス相互作用を検出するための細胞凝集アッセイ

Abstract

出典:Restrepo, S., et al., Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、HEK細胞凝集アッセイを通じてシナプス細胞接着分子間の細胞間相互作用を測定する技術を実演します。このアッセイでは、所望のシナプス前細胞接着分子と蛍光タンパク質を発現する同数のHEK細胞を、シナプス後細胞接着分子と別の蛍光タンパク質を発現するHEK細胞と混合します。細胞接着分子間の相互作用により、細胞は凝集し、これは蛍光顕微鏡で測定できます。

Protocol

1. 細胞培養とトランスフェクション

1. 4.5 g/Lグルコース、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム、および10% FBSを添加したDMEM、1x(Eagle's MediumのDulbecco's Modification)でHEK細胞培地を作製します。滅菌フィルター。
2. 凝集アッセイに適したリガンドと受容体を事前に決定します.
   手記：この研究では、ニューレキシン3α SS4+/-とその既知のリガンドの1つであるLRRTM2を使用しました。目的のリガンドおよび受容体は、pcDNA3.1のcDNAから発現した。ギブソンアセンブリを使用して、Neurexin3αをpcDNA3.1に挿入しました。ニューレキシン3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. HEK293T細胞を準備します。
   1. 1つのT-75フラスコでHEK293T細胞をコンフルエントに増殖させます。
   2. コンフルエントしたら、2 mLのトリプシンを使用し、37 °Cのインキュベーターに2分間入れます。フラスコに6 mLのHEK培地を加えて細胞を再懸濁し、8 mLすべてを15 mLのコニカルチューブに移します。
   3. ペレットを500 x gで5分間ペレット化し、HEK細胞培地に再懸濁して合計8 mLにします。
   4. 細胞をカウントし、735,000個の細胞を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。HEK細胞培地を使用して、各ウェルの最終容量を2 mLに調整します。
   5. 37°Cのインキュベーターに入れ、細胞が一晩または50〜60%のコンフルエント度に達するまで増殖させます。
4. リン酸カルシウム法を用いて細胞HEK293Tトランスフェクションします。
   1. well-1を3 μgの目的のタンパク質でトランスフェクションし、1 μgの蛍光タンパク質(3 μgのpcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4-および1 μgのmCherry)と同時トランスフェクションします。
   2. ステップ1.4.1.と同様にwell-2をトランスフェクションしますが、目的の変異タンパク質(pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-)を使用します。
   3. well-3を3 μgの目的のリガンドでトランスフェクションし、1 μgの別の蛍光タンパク質(3 μgのpcDNA3.1 LRRTM2および1 μgのGFP)と同時トランスフェクションします。
   4. ネガティブコントロールとして機能するようにwell-4およびwell-5をトランスフェクションします:well-4には1 μgのGFPを、well-5には1 μgのmCherryを添加します。
   5. 追加の条件または制御が必要な場合は、別のプレートを準備します(手順1.4.1-1.4.4と同様)(Neurexin3α^{WT / A687T} SS4 +).
      手記：トランスフェクションの効率は、トランスフェクションの24時間後に落射蛍光顕微鏡で分析され、トランスフェクションされた蛍光タンパク質を発現する細胞の数として定量されます。より合理化されたアプローチには、蛍光タンパク質と目的のリガンドをコードするバイシストロンベクターを用いたHEK細胞のトランスフェクションが含まれ、コトランスフェクションよりも強く推奨されます。この研究の場合、α ノイレキシンは ~4.3 kb であり、バイシストロン系を使用して低い蛍光強度が観察されたため、同時トランスフェクションが必要でした。
5. トランスフェクションの48時間後、凝集のために細胞を回収します。
   1. PBSで各ウェルを2回洗います。
   2. PBS中の10 mM EDTAを1 mL各ウェルに添加して、細胞間相互作用を穏やかに解離させ、プレートを37°Cで5分間インキュベートします
      手記：トリプシンは、研究における接着分子のタンパク質分解性切断の可能性があるため、ステップ1.5.bには推奨されません。さらに、EDTA添加後、細胞が周囲条件にさらされるため、プロトコルは完了するまで停止できない場合があります。
   3. プレートを軽くたたいて細胞を剥がし、各ウェルを別々の15 mLコニカルチューブに回収します。
   4. コニカルチューブを500 x g、室温で5分間遠心分離します。
6. 細胞がペレット化している間に、各微量遠心チューブの上部に各条件をラベル付けして、6つのインキュベーションチューブを準備します.
   手記：GFPおよびmCherry条件の各順列は、すべての実験条件と適切なコントロールを網羅するために使用する必要があります。例:1.GFP/mCherry、2.mCherry/LRRTM2-GFP 3。GFP/ノイレキシン3α^WT SS4--mCherry, 4.GFP/ノイレキシン3α^A687T SS4- -mチェリー, 5.ニューレキシン3α^WT SS4--mCherry/LRRTM2-GFP, 6.ニューレキシン3α^A687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP.さらなる条件と制御に対応するために、追加のチューブを作成します。
7. 上清を除去し、10 mM CaCl₂および10 mM MgCl₂を37°Cに温めた500 μLのHEK培地に細胞を再懸濁します
   手記：CaCl₂とMgCl₂の添加により、接着分子の結合が再確立され、問題の細胞間相互作用パートナーが接着のために二価カチオンを必要とする場合にのみ必要となります。
8. 血球計算盤を使用して各 15 mL コニカルチューブ内の細胞をカウントし、ステップ 1.6 から各条件の 200,000 個の細胞を適切なチューブに分注し、総容量 500 μL.
   で 1:1 ミックスします 手記：量を数えて分量するのに、条件ごとに5分しかかかりません。
9. チューブを室温で低速チューブローテーターでインキュベートします。

2. 画像取得

1. 特定のサンプルの顕微鏡取得パラメータを最適化します。この例では、画像は広視野顕微鏡で撮影されました。5倍の空中対物レンズ(NA:0.15;WD:20000μm)を使用して、分析に十分な大きさのフィールドが得られます。
2. ステップ 1.8 で HEK 細胞の 2 つの条件を混合した直後に、ベースラインの凝集を評価します。これらは「タイムゼロ」画像になりました。
   1. 各サンプル混合物の40 μLを帯電した顕微鏡スライドにピペットで移動し、488チャンネルと561チャンネルの両方で蛍光下で画像
   化します。
   2. サンプル滴ごとに1つの焦点面で3つの異なる視野を取得します。
3. 「時間60」画像として60分で最終画像を取得します。
   1. 60分間のインキュベーション後の混合物の「時間60」画像を取得するには、回転チューブから各条件の別の40 μLサンプルを採取し、各サンプルをチャージしたスライドにピペットで移します。手順 2.2.
      のイメージ 手記：細胞凝集は、飽和が起こるまで15分ごとにチェックする必要があります。凝集のタイミングは、テストするタンパク質によって異なります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL ディスポーザブルマイクロチューブ(スナップキャップ付き	VWRの	〒89000-028	HEK細胞の混合集団のインキュベーション
1000 mL ラピッドフローフィルターユニット、0.2 um aPES メンブレン	サーモフィッシャー	〒567-0020	HEK培地の滅菌
15 mL SpectraTube遠心分離チューブ	ウォードの科学	470224から998	HEK細胞の採取
6ウェル無菌組織培養プレート	VWRの	100062-892	HEK細胞の培養
塩化カルシウム	シグマ	223506から500G	リン酸カルシウムトランスフェクション、HEK細胞再懸濁
遠心分離機 - Sorvall Legend RT	Kendroラボラトリー製品	75004377	HEK細胞の採取
CO2細胞インキュベーター	サーモサイエンティフィック	ヘラセル150i	増殖中のHEK細胞のインキュベーション
DMEM、1x (Eagle's MediumのDulbecco's Modification)、4.5 g/Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム	コーニング	10-013-履歴書	HEKセルのメンテナンス
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水PBS(1X)	ギブコ	14190-144	HEK細胞の継代・回収
エチレンジアミン四酢酸	シグマ	ED-500G	HEK細胞の採取
ファルコンベント式培養フラスコ、75cm2成長面積	コーニング	9381M26	HEK細胞の培養
ウシ胎児血清	シグマ	17L184	HEKセルのメンテナンス
HEK293Tセル	ATCCの		モデルシステム
イメージJ	NIHの	V:2.0.0-RC-69 / 1.52P	画像解析
塩化マグネシウム六水和物	シグマ	M9272-500Gの	HEK細胞の再懸濁液
リン酸二塩基性無水ナトリウム	フィッシャーバイオ試薬	BP332-500	リン酸カルシウムトランスフェクション
トリプシン0.25%(1X)溶液	GEヘルスケアライフサイエンス	01 SH30042月	HEK細胞の継代
チューブローテーター			HEK細胞の混合集団のインキュベーション
UltraClear Microscopeのスライド。ホワイトフロスト、正電荷	デンビルサイエンティフィック株式会社	M1021	画像取得
広視野顕微鏡	ツァイス	アクシオバート200M	画像取得