In Situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイ

要約

出典:Wang, X., et al., 近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖系列におけるリボヌクレオタンパク質複合体アセンブリのその場検出.J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、線虫細胞におけるin situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイについて説明しています。目的のタンパク質が近接しているため、二次抗体に付着したPLAプローブの助けを借りて環状DNAテンプレートが生成されます。プローブは増幅溶液を使用してさらに増幅され、長い一本鎖DNAが生成され、続いて検出器プローブがハイブリダイゼーションされるため、細胞内のタンパク質間相互作用の局在化が可能になります。

プロトコル

>注:このプロトコルは、潜在的な相互作用パートナーが両方ともタグ付けされているC.エレガンス株を使用します。ネガティブコントロール株を使用することを強く推奨します。ネガティブコントロール株では、1つのタグ付きタンパク質が別のタグ付き候補相互作用パートナーと相互作用することが期待されません。ここでは、DLC-1が線虫のGFPと相互作用するとは予想されないため、バックグラウンドを評価するためのネガティブコントロールとしてGFPのみを使用しました。GFPタグ付きOMA-1を実験株として使用しましたが、予備データはDLC-1との相互作用を示唆しています。3xFLAGタグ付きDLC-1と制御タンパク質および試験タンパク質を共発現する線虫株は、このテキストでは3xFLAG::D LC-1;GFPおよび3xFLAG::D LC-1;OMA-1::GFP(ご要望に応じて入手可能な株;詳細については、材料の表をご覧ください)。ここでは、3xFLAGタグとGFPタグを使用します。ただし、他のタグは、その抗体がPLAキット試薬と互換性がある限り、置換できます。

1. 動物の世話

1. 大腸菌のOP50株を播種した線虫増殖培地(NGM)プレートに線虫を保管し、GFPの最適な発現のために24°Cに維持します。
2. 成虫を2〜3日ごとに通過させて、ワームを繁殖させ、十分に栄養を与え続けます。

2. 同期カルチャの準備

1. 十分に栄養を与えられた、重力のある雌雄同体のプレートを漂白することにより、ワームを同期させます。漂白プロトコルは、Porta-de-la-Rivaらに記載されています。胚を24°Cの遠心チューブで一晩孵化させ、10 mLのM9最小培地(M9)バッファーで端から端まで回転させます。これにより、逮捕されたL1幼虫の培養物が生成されます。
2. 停止したL1ステージの幼虫のチューブを氷上で10分間インキュベートし、次にチューブに氷冷した1x M9を補充します。
3. 遠心分離機を使用して、幼虫を600 x gで4°Cで5分間ペレット化し、上清が1〜2 mLのみ残るように上清を慎重に吸引します。
4. 幼虫のペレットを再懸濁し、マイクロピペットを使用して、懸濁した幼虫培養物2μLをスライドガラスに移します。幼虫の培養物の密度を決定するために存在する幼虫の数を数え、ステップ2.5.
   でワームの播種をガイドするのに役立ちます 手記：10〜15個のL1幼虫/1μLの密度は播種に適しています。
5. マイクロピペットを使用して、60 mm OP50プレート上に約100〜120 L1ステージの幼虫を播種するために必要な幼虫培養物の量を移します。例えば、密度が10 L1幼虫/培養物1 μLの幼虫培養物の10 μLをシードします。
   手記：幼虫を播種するために40μLの容量を超えないようにしてください、さもなければ過剰な液体はOP50芝生を混乱させます。培養量が40μLを超える場合は、手順2.3〜2.4を繰り返して、容量をさらに減らし、幼虫培養の密度を高めます。
6. 24°Cで線虫を増殖させ、L1がプレート上に播種された時間を記録し、定期的に発生段階をチェックして解剖の理想的な時期を特定します
   手記：L1sの播種から52時間後、24°Cで培養された線虫は通常、若年成人期にあり、これは生殖腺を標的とするPLAの解剖に理想的な段階です。ただし、同期した線虫が若年成人期に到達する実際の時間は、系統や孵卵温度によって異なる場合があります。

3. 解剖/生殖腺の押し出し

>注:生殖腺を標的とするPLAが正常に機能するためには、生殖腺を押し出すための解剖が必要です。このアプローチは胚を放出することもでき、このプロトコルをPLAに使用しても機能します(詳細については、ディスカッションを参照してください)。解剖後、ネガティブコントロールサンプルと実験サンプルの両方を固定し、PLAを並行して処理します。また、目的のタンパク質パートナーの発現パターンを実証するために、蛍光共免疫染色の目的で追加のサンプルセットを調製することも提案されています。

1. 500 μLの1x M9 + レバミゾール(最終濃度2.5 mM)が入った時計ガラス皿に、30〜40匹の若年成虫を選別します。ワームを収集した後、ほとんどのメディアを慎重に取り除いて廃棄し、ワームとともに移動した細菌を取り除きます。
2. 1x M9 + レバミゾールを新たに500 μL加え、ピペットを使用して培地を穏やかに引き上げて分注し、線虫をすすぎます。ほとんどのメディアを慎重に取り除いて廃棄し、ワームと一緒に移動したバクテリアを取り除きます。
   1. すべてのバクテリアが除去されるまで、この手順を2〜3回繰り返します。洗浄が完了したら、約100μLの培地に寄生虫を放置して水分を保ちます
      手記：線虫を7分以上メディアに放置しないでください、これは解剖中の生殖腺の押し出しを損なうからです。解剖顕微鏡の助けを借りて洗浄を行い、媒体の除去を監視して、ワームが失われないようにします。
3. ガラス製またはポリエチレン製のピペットを使用して、0.001%のポリ-L-リジンでコーティングされた25 mm x 75 mmの顕微鏡スライドにワームを移します(この手順で使用するスライドの周囲にエポキシコーティングが施されており、それぞれ14 mm x 14 mmの3つのワークスペースが残ります)。余分なメディアを取り除き、約10〜15μLのメディアが残るようにします。
4. 解剖顕微鏡の助けを借りて、2つの261/2ゲージ針を使用して、一方の針をもう一方の針の上に置き、端が一対のはさみを形成するようにします。この方法で向きを変えた針を使用して、咽頭の後ろの線虫を切り取り、生殖細胞系を解放します。5分以内にすべてのワームを解剖します.
   手記：解剖の実施方法の詳細については、GervaiseとArurによる以前の出版物を参照してください。
5. すべてのワームを解剖した後、22 mm x 40 mmのカバースリップをスライドにそっと置き、スライドに対して垂直になるようにします。カバースリップの端がスライドからぶら下がっている必要があります。
6. ドライアイスの上に保持された事前に冷やしたアルミニウムブロックでスライドを少なくとも20分間凍結します。氷の膨張によりカバースリップが緩むのを防ぐために、冷やした鉛筆をカバースリップの上にそっと置きます。

4. 固定/ブロッキング

1. 固定の準備ができたら、鉛筆などの先端が鈍い工具でカバースリップをはじき、すぐにスライドを新鮮な氷のように冷たいメタノール(-20°Cに冷却)が入った瓶に1分間浸します。
2. サンプルを囲むスライドの端をそっと拭き、次の試薬がサンプルの周りの表面張力によって保持されるようにします。150 μL の固定液 (2% ホルムアルデヒド含有 100 mM KH₂PO_4、pH = 7.2) を RT.
   で 5 分間アプライします。 手記：また、メタノール/アセトン固定法も試験し、PLA反応に適合していることがわかりました。
3. スライドをペーパータオルに垂直に90°の角度で触れて、固定剤がスライドから流れ落ちてペーパータオルに吸収されるようにします。50 mLの1x PBS/1% Triton X-100/1%ウシ血清アルブミン(PBT/BSA).
   手記：Coplinジャーまたは他のタイプの染色ジャーは、このブロッキングステップと以下のセクション6〜9の洗浄ステップに推奨されます。これらは、ブロッキングバッファーまたは洗浄バッファーをサンプルと効率的に交換するのに十分な容量を提供します。
4. 10%の正常なヤギの血清を含むPBT/BSAの解決とのブロックスライド。スライドを囲む端をやさしく拭き、100μLの溶液をスライドに塗布します。湿潤チャンバー内のRTで1時間インキュベートします.
   手記：このステップは、αFLAG一次抗体による染色に強く推奨されます。湿潤チャンバーは、スライドがインキュベートするときにスライドが横たわるように、トレイにテープでガラスピペットを固定することによって構成されています。湿らせたタスクワイプ(Table of Materials)をトレイに配置して、トレイの内部湿度を上げ、蒸発を防ぎます。蓋とトレイはホイルで覆われており、感光性ステップ中にサンプルを光から保護します。
5. スライドをペーパータオルの上に置き、PBT/BSA/10%NGS溶液をスライドから流し、スライドの端をやさしく拭きます。ブロッキング試薬(Table of Materials)を使用してスライドをブロックします。14 mm x 14 mmのスペースに1滴を塗布します。スライドを湿ったチャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。

5. 一次抗体のインキュベーション

>注:最良のPLA結果と最小限のバックグラウンドを得るためには、一次抗体の希釈係数を最適化する必要がある場合があります(詳細については、ディスカッションを参照してください)。さらに、一次抗体は、PLAに使用される二次抗体の特異性に一致する異なる宿主で産生する必要があります。

1. スライドをペーパータオルの上に置き、ブロッキング試薬がスライドから流れ落ちるようにし、端をやさしく拭きます。抗体希釈剤(Table of Materials)を使用して、一次抗体を希釈します。14 mm x 14 mmのスペースに40 μLの一次抗体溶液を塗布します。
2. スライドを湿ったチャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。

6. PLAプローブ(二次抗体)のインキュベーション

>注:ステップ6〜9では、RTで洗浄バッファーAとBを使用します。バッファーを4°Cで保存する場合は、使用する前にRTまで温めてください。

1. スライドを50 mLの1x Wash buffer A(Table of Materials)で5分間2回洗浄し、RTでCoplinジャーに入れます。Coplinジャーを60rpmに設定されたオービタルシェーカーにセットします。
2. スライドをペーパータオルの上に置き、ウォッシュバッファーをスライドから流し、端をそっと拭きます。PLUSプローブとMINUSプローブを含む40 μL溶液を調製します(抗体希釈液で1:5に希釈)。14 mm x 14 mmの各スペースに溶液を塗布します。
3. スライドを湿潤チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。

7. ライゲーション

1. スライドを50 mLの1x Wash buffer Aと共に5分間、Coplinジャー内のRTで2回洗浄します。Coplinジャーを60rpmに設定されたオービタルシェーカーにセットします。
2. ライゲーションバッファー(材料表)を超純水で1:5に希釈します。このバッファーを使用してリガーゼ(材料表)を1:40に希釈し、ライゲーション溶液のワーキングストックを調製します。
   1. スライドをペーパータオルの上に置き、ウォッシュバッファーがスライドから流れ落ちるようにし、端をそっと拭きます。ライゲーション溶液40μLを14 mm x 14 mmの各スペースに塗布します。
3. スライドを湿潤チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。

8. 増幅

>注:赤色蛍光色素を含む検出試薬(材料表)を使用すると、C.エレガンス組織のバックグラウンドが最小限に抑えられます。

1. スライドを50 mLの1x Wash buffer Aと共に5分間、Coplinジャー内のRTで2回洗浄します。Coplinジャーを60rpmに設定されたオービタルシェーカーにセットします。
2. 増幅赤色緩衝液(材料表)を超純水で1:5に希釈します。このバッファーを使用してポリメラーゼ(材料表)を1:80に希釈し、増幅溶液のワーキングストックを調製し、光から保護します。
   1. スライドをペーパータオルの上に置き、ウォッシュバッファーがスライドから流れ落ちるようにし、端をそっと拭きます。増幅溶液40μLを14mm x 14mmの各スペースに塗布します。
3. 湿潤チャンバー内でスライドを37°Cで1時間40分間インキュベートし、サンプルを光から保護するために、湿潤チャンバーがホイルで覆われていることを確認してください。

9. 最終洗浄

1. スライドを2回、10分間、RTで50mLの1x洗浄バッファーB(Table of Materials)とともにCoplinジャーで洗浄します。Coplinジャーを60rpmに設定されたオービタルシェーカーにセットします。
2. スライドを1回、0.01x洗浄バッファーB50 mLとともにRTでCoplinジャー内で1分間洗浄します。Coplinジャーを60rpmに設定されたオービタルシェーカーにセットします。この緩衝液は、洗浄緩衝液Bを超純水で希釈することによって調製されます。

10. カバースリップの取り付け

1. 余分な洗浄バッファーをスライドからペーパータオルに流し、エポキシコーティングされたスライドの周囲に残っている残留バッファーを拭き取ります。
2. 10 μLの封入剤(材料表)をサンプルに加え、その上にカバースリップをそっと置き、封入剤が広がるようにします。
3. カバースリップの端の周りをマニキュアでペイントして、カバースリップを密封してスライドさせます。マニキュアの塗布は、生殖細胞系を損傷するカバースリップを動かさないように優しくしてください。顕微鏡で見る前に、スライドを光から保護しながら、RTでマニキュアを少なくとも20分間硬化させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16%パラホルムアルデヒド溶液	電子顕微鏡サービス	15710	4%の作業溶液を作るために使用
1M KH2PO4	シグマ	P0662	1Mの作業用ストックを準備します
1x M9	諸	諸	10倍ストックを1倍で使用するように調製。プロトコルについては wormbook.org を参照
1x PBSの	諸	諸	プロトコルについては wormbook.org を参照してください
26.5ゲージニードル	エクセルインターナショナル	26402	解剖に使用する針
BSAの	ランパイア	7500802
遠心分離管	サーモサイエンティフィック	05-529C	同期に使用される50mlオークリッジ遠心分離管
共焦点顕微鏡	ツァイス	880
コプリンジャー	ポリラボ	62101
サンプルを凍結するためのカバースリップ	グローブサイエンティフィック	1411-10	22x40mm、No.1
カバースリップからシールスライド	グローブサイエンティフィック	1404-15	22x22mm、No.1.5
免疫蛍光用のDAPI用封入剤	ベクトル	H-1200
リガーゼ	シグマ・アルドリッチ	DUO82029	Duolink 1x Ligaseは、Duolink In Situ Detection Reagents Redキットの一部として提供されますDUO92008
増幅赤色バッファー	シグマ・アルドリッチ	DUO82011	Duolink 5x Amplification Redバッファーは、Duolink In Situ Detection Reagents Redキットの一部として提供されますDUO92008
ライゲーションバッファー	シグマ・アルドリッチ	DUO82009	Duolink 5x ライゲーションバッファーは、Duolink In Situ Detection Reagents Red キットの一部として提供されますDUO92008
抗体希釈剤	シグマ・アルドリッチ	DUO82008	Duolink抗体希釈剤、DUO92004とDUO92002が付属しています、注:1x PBS / 1%BSA溶液も抗体を希釈するための代替品として使用できます。
ブロッキングソリューション	シグマ・アルドリッチ	DUO82007	Duolinkブロッキングソリューション、DUO92004とDUO92002が付属しています
PLA用封入剤	シグマ・アルドリッチ	DUO82040	Duolink In Situ DAPI封入剤
マイナスプローブ	シグマ・アルドリッチ	DUO92004	Duolink In Situ Probe アンチマウス MINUS
PLUSプローブ	シグマ・アルドリッチ	DUO92002	Duolink In Situ プローブ アンチウサギ PLUS
ウォッシュバッファーA	シグマ・アルドリッチ	DUO82046	Duolink In Situ洗浄バッファーA
ウォッシュバッファーB	シグマ・アルドリッチ	DUO82048	Duolink In Situ洗浄バッファーB
ポリメラーゼ	シグマ・アルドリッチ	DUO82030	Duolinkポリメラーゼは、Duolink In Situ検出試薬レッドキットの一部として提供されますDUO92008
エピ蛍光顕微鏡	ライカ		DFC300Gカメラ、DM5500B顕微鏡
ヤギアンチマウスアレクサ594	ジャクソンイムノ	115-585-146	1:500で使用
ヤギの抗ウサギAlexa 488	ジャクソンイムノ	111-545-144	1:200で使用
ガラスピペット	コーニング	7095B-5X
レバミゾール	アクロスオーガニックス	187870100	250 mMの作業用ストックを準備します
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A454
マウスアンチFLAG	シグマ	F1804	免疫蛍光およびPLAに1:1000で使用し、正常なヤギ血清とのプレブロックを推奨
マニキュア	LAカラー	CNP195
線虫増殖培地(NGM)	諸		プロトコルについては wormbook.org を参照してください
ノーマルヤギ血清	ジャクソンイムノ	005-000-121
ポリエチレンパスツールピペット	グローブサイエンティフィック	135030
ポリ-L-リジン	シグマ・アルドリッチ	P1524	0.1%水溶液として調製し、-20°Cで保存し、水で1:100に希釈してスライドをコーティングします
ペトリ皿	トライテック	PD7060	直径60mm
ウサギ抗GFP	サーモフィッシャー	G10362	免疫蛍光法の場合は1:200、PLAの場合は1:4000で使用
スライド	サーモフィッシャー	30-2066A-ブラウン	バー付きの3つの正方形の14x14mmオートクレーブ可能なスライドは、フィッシャーサイエンティフィックを通じてカスタムオーダーされています。Poly-L-Lysineを研究室のスライドに添加
次亜塩素酸ナトリウム溶液	フィッシャーサイエンティフィック	SS290-1
タスクのワイプ	キムテック	34120	4.4x8.4インチのタスクワイプ
トレイ(242x241x20mm)	サーモフィッシャー	240845	湿ったチャンバーを作るために使用されます
トリトンX-100	アクロスオーガニックス	327372500
純水	ミリQ		Milli-Q Integral Water Purification Systemから得られる超純水
ウォッチグラス	カロライナバイオロジカル	742300
-20°C冷凍庫
-80°C冷凍庫
アルミホイル
OP50株大腸菌
オービタルシェーカー
テープ
この研究で使用された線虫株(どちらもご要望に応じて利用可能)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMTの376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP;参考文献24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+);参考:本研究

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