相互作用研究のための共免疫沈降タンパク質の調製のための膜上タンパク質消化

要約

出典:Obama, T. et al., 膜上消化技術を用いたタンパク質間相互作用の評価。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、タンパク質間相互作用解析のためのPVDF膜上の共免疫沈降タンパク質複合体のデモを行っています。複合体から還元されたタンパク質をトリプシンで処理して、小さなペプチドで個々のタンパク質を切断し、残りのペプチドをPVDF膜から抽出しました。次に、複合体中の両方のタンパク質に由来するプルペプチドを乾燥させ、さらなる分析のために低濃度のギ酸に再懸濁しました。

プロトコル

1. 免疫沈降

>注:次のセクションで説明するように、非ナトリウムドデシル硫酸(SDS)溶解バッファーとクエン酸溶出を使用しました。ただし、代替の社内免疫沈降法の使用は、LC-MS/MSサンプルの調製にも適用できる場合があります。

1. エピトープタグのみをコードするベクターまたは融合タンパク質で培養細胞をトランスフェクションします。代表的なデータを取得するには、J774細胞(1 x 10⁶)を緑色蛍光タンパク質(GFP)単独またはカチオン性リポソームを使用してGFP融合Capn6(カルパイン-6遺伝子)をコードするベクターで移します。
2. 磁気ビーズに対するコンジュゲート抗体。
   1. この目的のために、1.5 mL試験管内の500 μLのクエンリン酸緩衝液(24.5 mMクエン酸、51.7 mM二塩基性リン酸ナトリウム、pH 5.0)に抗GFP抗体(2 μL/反応)と磁気ビーズ(25 μL/反応)を混合します。
   2. 混合物を室温で50rpmで1時間回転させます。次に、IgG標識ビーズを0.1%ポリオキシエチレン(20)モノラウリン酸ソルビタンを含むクエンリン酸緩衝液で3回洗浄します。
3. トランスフェクションした細胞を適切な溶解バッファーを用いて溶解します。代表的なデータを取得するには、トランスフェクションした細胞を氷上で30分間溶解します 400 μL の溶解バッファー (50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.5% poly(oxyethelene) octylphenyl ether) in 40 μmol/L phenyl/L containing 40 μmol/L phenyl-sulfonyl fluoride, 50 μg/mL leupeptin, 50 μg/mL aprotinin, 200 μmol/L sodium orthovanadate, トランスフェクションの24時間後に1.5 mL試験管に1 mMエチレングリコール四酢酸(EGTA)。
4. 15,000 x gで5分間遠心分離してライセートを清澄化し、上清を回収します。
5. ライセートをプリクリアします。標識されていない磁気ビーズ(25 μL/反応)を1.5 mL試験管に添加します。ビーズを500 μLのクエンリン酸緩衝液で3回洗浄します。最終洗浄でクエンリン酸緩衝液を除去した後、磁気ビーズの上に細胞溶解物を添加します。ローテーターを使用して、室温で50rpmで30分間混合物を回転させます。
6. 試験管を磁気スタンドに5分間置いて磁気分離し、細胞溶解液を回収します。メーカー指定のマグネットスタンドの使用をお勧めします。
7. 標的タンパク質を結合ビーズに結合します。免疫グロブリン(Ig)G標識ビーズを磁気スタンドに5分間置いて磁気分離し、クエン酸バッファーを廃棄した後、分離したビーズに細胞溶解物を添加します。
8. 混合物を室温で50rpmで1時間回転させます。
9. 標的タンパク質を遊離非標的タンパク質から分離します。0.1%ポリオキシエチレン(20)モノラウリン酸ソルビタンを含むクエンリン酸緩衝液500μLを使用して、ビーズを3回洗浄します。最終洗浄後、クエン酸バッファー (pH 2–3) 30 μL を加え、室温で 5 分間インキュベートして標的タンパク質を溶出します
   手記：免疫沈降からの回復が不十分な場合は、FLAGやHISなどの代替エピトープタグを使用することで、効率が向上する可能性があります。溶出効率が不十分な場合は、SDSベースの溶液などの他の溶離液を使用することで効率が向上する可能性があります。

2. タンパク質の膜上消化

>注:外因性タンパク質による汚染を避けるためには、タンパク質を含まない材料と機器を使用する必要があります。さらに、オペレーターは、ヒトタンパク質による汚染を避けるために、サージカルマスクと手袋を着用することをお勧めします。

1. PVDFメンブレンは、メタノールで拭き取り、使用直前に乾燥させた手術用ハサミで3mm×3mmにカットします。
2. きれいなアルミホイル上のPVDFメンブレンに2〜5μLのエタノールを加えます。
3. 完全に乾燥する前に、溶離剤(各2〜5μL、サンプルあたり4〜6個)を親水性PVDFメンブレンに加え、メンブレン表面がつや消しになるまでメンブレンを風乾します。乾燥したメンブレンは4°Cで保存できます。
4. すべてのメンブレンを1.5 mLのプラスチックチューブに移し、20〜30 μLのエタノールを加えてメンブレムを親水性にした後、ピペットを使用してエタノールを除去します。
5. メンブレンが完全に乾く前に、200 μLのジチオスレイトール(DTT)ベースの反応溶液(80 mM NH₄HCO₃、10 mM DTT、および20%アセトニトリル)を加え、56°Cで1時間インキュベートします。
6. 反応液を300 μLのヨードアセトアミド溶液(80 mM NH₄HCO₃、55 mMヨードアセトアミド、および20%アセトニトリル)と交換し、暗所で室温で45分間インキュベー
トします。
7. メンブレンを1 mLの蒸留水で2回、1 mLの2%アセトニトリルで1回、ボルテックスミキシングにより>10秒間洗浄します。
8. 凍結乾燥されたMSグレードのトリプシン(Table of Materials)を反応溶液(70%アセトニトリルを含む30 mM NH₄HCO₃)に直接溶解します。1 μgのトリプシンを含む反応溶液(材料表)(30 mM NH₄HCO₃、70%アセトニトリルを含む)100 μLを加え、37 °Cで一晩インキュベー
トします。
9. トリプシン消化物を含む反応溶液をピペットを使用して清潔な1.5mL試験管に移します。
10. 100 μLの洗浄液(70%アセトニトリル/1%トリフルオロ酢酸)をメンブレンに加え、60°Cで2時間インキュベートします。さらに100μLの洗浄液をメンブレンに加え、10分間超音波処理します。次に、洗浄液を回収し、反応液と混合します。
11. 試験管を実験用フィルムで覆い、針でいくつかの小さな穴を開けます。真空濃縮器を使用して溶液を乾燥させます。
12. 残渣を0.2%ギ酸の10μLに溶解します。遠心分離後(12,000 × g、室温で3分間)、上清を試料チューブに移します><。 手記：洗浄は、このセクションの重要なステップです。膜上タンパク質消化では、固定化タンパク質を含む膜を還元およびアルキル化した後、蒸留水でそれぞれ10秒以上洗浄し、続いて2%アセトニトリルをそれぞれ10秒以上洗浄することが、試薬の除去にとって重要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトニ トリル	和光	014-00386
クエン酸	和光	030-05525
DTTの	ナカライ・テスク	14112から94
Dynabeads プロテイン G	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10003Dの
蟻酸	和光	066-00461
ヨードアセトアミド	和光	095-02151
リポフェクタミン3000	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L3000008
Living Colors A.v. モノクローナル抗体 (JL-8)	クロンテック	632380
NaCl	和光	〒191-01665
NH4HCO3	和光	018-21742
ノニデット P-40	シグマ	N6507	ポリ(オキシエチレン)オクチルフェニルエーテル(n = 9)
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ	P8465
シーケンシンググレード修飾トリプシン	プロメガ	V5111	トリプシン
オルトバナジン酸ナトリウム	シグマ	S6508
リン酸ナトリウム二塩基性二水和物	シグマ	71643
TFAの	和光	〒206-10731
トリス	和光	〒207-06275
Tween-20 (トゥイーン 20	和光	〒160-21211

の 型 )