リガンドと分析物間の相互作用を検出するためのバイオレイヤー干渉法技術

要約

出典:Desai, M., et al.転写におけるタンパク質間相互作用を研究するための生体層干渉法(BLI)の応用。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、リガンドと標的分析物との間の分子間相互作用をリアルタイムで検出するバイオレイヤー干渉法(BLI)技術を実演します。BLIは、バイオセンサー表面の固定化されたリガンドの層から反射された白色光が溶液中の分析対象物と相互作用する際の干渉パターンの変化を測定します。

プロトコル

1. バイオセンサーの水分補給とアッセイのセットアップ

1. BLItzマシンの電源を入れます。
2. マシンがマシンの背面にあるUSBデータ出力ポートを介してコンピューターに接続されていることを確認します。
3. コンピュータで、関連するソフトウェア(BLItz Proなど)を開き、画面の左側にあるAdvanced Kineticsをクリックします。
4. ソフトウェアで、実験に関するすべての適切な情報(実験名、説明、サンプルID、タンパク質濃度など)をそれぞれの見出しの下に入力します。
5. [Biosensor Type] をクリックし、ドロップダウン メニューから [Ni-NTA] を選択します。
   1. [Run Settings] 見出しの下で、[Shaker] が [Enable] に設定されていることを確認します。
   2. 「ステップ タイプ リスト」(Step Type List) の見出しの下に、「初期ベースライン」(Initial Baseline)、「荷重」(Loading)、「ベースライン」(Baseline)、「関連付け」(Association)、および「Dissociation」(解離) の 5 つの項目が表示されていることを確認します。
      手記：各ステップの期間は、必要に応じてデフォルトから変更できます。最適な結果を得るには、Initial Baseline と Baseline に 30 秒以上を使用します。120 秒は関連付けと解離です。ローディングステップの持続時間(120秒から240秒の範囲)は、リガンドの濃度と、リガンド上のHisエピトープタグのNi-NTAバイオセンサーへの親和性に依存します。
6. 水和したNi-NTAバイオセンサーをPCRチューブから取り外し、バイオセンサーの広い部分をマウントにスライドさせて、マシンのバイオセンサーマウントに貼り付けます.
   手記：実験中にバイオセンサーを乾燥させないでください。
7. 0.5 mLの黒色の微量遠心チューブを機械のチューブホルダーに入れ、BLIバッファー400μLをピペットで入れます。
8. チューブホルダーが機械の黒い矢印の前に来るように、機械のスライダーが配置されていることを確認します。
9. バイオセンサーの先端が微量遠心チューブ内のバッファーに沈むように、機械のカバーを閉じます。
10. ソフトウェアの [次へ] をクリックして、初期ベースラインの記録を開始します。

2. バイオセンサーへのリガンドのロード

1. Initial Baselineステップの録音が終了したら、マシンのカバーを開けます。
2. スライダーを右に動かして、ドロップホルダー(チューブホルダーの代わりに)が黒い矢印の前に来るようにします。
3. 透析したHisタグ付きリガンドを4μL滴下し、装置のカバーを閉じます。
   注:使用するリガンドの最適濃度は、タンパク質ごとに異なる場合があります。通常、1.0〜2.0 mg / mLの濃度は、バイオセンサーの先端でNTAを240秒で飽和させるのに十分です。
4. ソフトウェアで、[次へ]をクリックしてロードを開始します。

3. 追加のリガンドを洗い流す

1. ローディングステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開けます。
2. スライダーを左に動かして、チューブホルダーが再び黒い矢印の前に来るようにします。
3. 機械の蓋を閉め、バイオセンサーの先端がチューブホルダー内のチューブのBLIバッファーに沈んでいることを確認します。
4. ソフトウェアでもう一度[次へ]をクリックして、ベースラインの記録を開始します。

4. 分析物とリガンドの会合

1. ベースラインステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開けます。
2. ドロップホルダーを取り外し、タンパク質をピペッティングで取り出し、二重脱イオン水(ddH₂O)で合計5回すすいで洗浄します。
   1. 洗濯後、ティッシュペーパーを使用してドロップホルダーの表面を清掃します。
3. ドロップホルダーを機械に戻します。
4. マシンのスライダーを右に動かして、ドロップホルダーが再び黒い矢印の前にくるようにします。
5. 透析した分析物4μLをドロップホルダーにピペットで移し、機械のカバーを閉じます。
6. ソフトウェアで、[次へ]をクリックして関連付けを開始します。

5. リガンドからの分析物の解離

1. 関連付けステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開きます。
2. マシンのスライダーを右に動かして、チューブホルダーが再び黒い矢印の前に来るようにします。
3. ソフトウェアで、[次へ]をクリックして解離を開始します。
4. 解離ステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開きます。
5. ドロップホルダーとチューブホルダーを取り外します。
6. 両方をddH₂Oで十分にすすぎ、タンパク質を洗い流します。
7. バイオセンサーを取り外し、安全に廃棄してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BLItzマシン	フォルテバイオ	45〜5000	デバイス
Ni-NTAバイオセンサートレイのディップ&リード	フォルテバイオ	〒18-5101	poly-Hisタグ付きタンパク質用のすぐに使用できるNi-NTAバイオセンサー
ドロップホルダー	フォルテバイオ	〒45-5004	デバイス
PCRチューブ(0.2 mL)	トーマス・サイエンティフィック	CLS6571	プラスチック製品
微量遠心チューブ(黒)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	03-391-166	プラスチック製品
キムワイプ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	06-666A	プラスチック製品
DTTの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R0861	ケミカル
EDTAの	ミリポアシグマ	E6758	ケミカル
MgCl2	ミリポアシグマ	M8266	ケミカル
NaCl	ミリポアシグマ	S9888	ケミカル
トリス-HCl	ゴールドバイオ	T095100	バッファ