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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. サンプル調製:細胞間ミキシングアッセイ
>注:次のプロトコルは、接着細胞の混合手順を説明しています。懸濁液中で培養した細胞に修飾することができます。
- トランスフェクションの前日に、6ウェルプレートに適切な数の細胞、例えば800,000個のHEK 293T細胞(ノイバウアー計数チャンバーで計数)を播種します。この数は、播種からトランスフェクションまでの時間に応じて変更でき、他の細胞タイプに合わせて調整できます。基本的な実験(すなわち、目的のタンパク質およびネガティブコントロール)を行うには、少なくとも4つのウェルを調製します。細胞を37°C、5%CO2でDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培地で培養し、ウシ胎児血清(10%)とL-グルタミン(1%)を添加します。
- 製造元の指示に従って細胞をトランスフェクションします(材料の表を参照)。
- 基本的な実験を行うには、目的タンパク質のプラスミドを「緑色」(単量体増強緑色蛍光タンパク質(mEGFP)または黄色蛍光タンパク質(mEYFP)など)または「赤色」(mCherryまたはmCardinal)蛍光タンパク質に融合させた別々のウェルでトランスフェクションします
手記：このプロトコルでは、APLP1-mEYFPとAPLP1-mCardinal、および対応するネガティブコントロール、例えば、ミリストイル化パルミトイル化mEYFP(myr-palm-mEYFP)および-mCardinal(myr-palm-mCardinal)に焦点を当てています。一般的には、200 ng - 1 μgのプラスミドDNAで十分です。トランスフェクション効率が高いと、接触している「赤」細胞と「緑」細胞を見つける可能性が高くなります。プラスミドとトランスフェクション試薬の量を変更して、トランスフェクション効率を最適化します。危うい：細胞をトランスフェクションする場合、細胞のコンフルエンシーは約70%である必要があります。細胞が過度にコンフルエントになると、トランスフェクション効率が低下します。細胞が十分にコンフルエントでない場合、トランスフェクションやミキシングはストレスを誘発し、ミキシング後に多くの細胞が適切に接着できなくなる可能性があります。
- トランスフェクション後4~2時間後に細胞混合を行います±。
- 増殖培地を取り出し、Mg2+およびCa2+を添加した1 mLのPBSで各ウェルを穏やかに洗浄します。次に、PBSを取り外します。(クリティカル)PBSをウェルエッジに落とし、洗浄中の細胞の剥離を防ぎます。
- ~50 μL のトリプシンエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 溶液を各ウェルに滴下して、細胞の剥離を促進します。37°Cで2分間インキュベートします。その後、6ウェルプレートをゆっくりと横方向に振って細胞を切り離します
手記：一部の細胞タイプでは、インキュベーション時間の延長が必要になる場合があります。
- 各ウェルに950 μLの増殖培地を添加し、数回上下にピペッティングして細胞を再懸濁し、ウェル底からすべての細胞を剥離します。(クリティカル)再懸濁後に大きな細胞凝集体が存在しないことを視覚的に確認することにより、細胞が適切に再懸濁され、互いに分離していることを確認します。そうしないと、混合後に多くの「赤」-「赤」または「緑」-「緑」の接点が得られます。
- 1つのウェル(対象タンパク質またはネガティブコントロール)の細胞溶液を対応するウェル、すなわち「赤」(例:APLP1-mCardinalトランスフェクト)から「緑」(例:APLP1-mEYFPトランスフェクション)細胞に移します。数回上下に静かにピペッティングして混合します。次に、混合細胞を35 mmガラス底皿(皿1皿あたり1 mLの混合細胞溶液と1 mLの成長培地)に播種し、播種した細胞を37°C、5%CO2でさらに1日間培養します。
2. サンプル調製:相互相関実験のためのポジティブコントロールと輝度分析のためのホモダイマーコンストラクト
- トランスフェクションの1日前に、600,000個のHEK 293T細胞を細胞計数チャンバーで計数し、35 mmガラス底皿に播種します。細胞を37°C、5%CO2で完全なDMEM培地(ステップ1.1を参照)で別の日培養します。
- メーカーの指示に従って、~250 ng のプラスミド DNA で細胞をトランスフェクションします。正の相互相関制御には、目的のタンパク質のFPに対応するmyr-palm-mCherry-mEGFPまたはmyr-palm-mCardinal-mEYFPなどの膜アンカー蛍光タンパク質ヘテロダイマーをコードするプラスミドを使用します。輝度キャリブレーションには、目的のタンパク質に融合したFPに対応する膜アンカーFPモノマーとホモダイマーの両方をコードするプラスミド(例:myr-palm-mEYFPおよびmyr-palm-mEYFP-mEYFP)を使用して、APLP1-mEYFPの輝度分析をキャリブレーションします。
- 細胞を37°C、5%CO2で完全DMEM培地(ステップ1.1を参照)で別の日培養します。
3. 共焦点レーザー走査型顕微鏡:セットアップとフォーカルボリュームキャリブレーション
>注:次のプロトコルは、この研究で使用したレーザー走査型共焦点顕微鏡でmEGFP/mEYFPおよびmCherry/mCardinalを使用して行われた実験用に書かれています。光学セットアップ、ソフトウェア設定(レーザーライン、ダイクロイックミラー、フィルター)、キャリブレーション色素の選択は、他のFPや顕微鏡のセットアップに合わせて変更される場合があります。
- 実験の少なくとも1時間前に顕微鏡とレーザーの電源を入れて、レーザーの安定性と温度の平衡を確保します。
- 100〜200 μLの適切な水溶性蛍光色素溶液(例については、材料の表を参照)を水またはPBSに調製し、10〜50 nMの範囲の濃度で焦点容量を較正します。
- 染料溶液を、清潔な35mmガラス底皿#1.5、すなわち厚さ0.16〜0.19mmの
の上に置きます。
手記：理想的には、厚さ公差が0.170 mm±0.005 mmなどの低い高性能カバーガラスを使用したディッシュを使用し、最適なカラーリング補正を可能にします(ステップ3.6)。次の実験では、後で使用するのと同じ種類の皿を使用することが重要です。
- 色素溶液を含むディッシュを対物レンズに直接置き(できれば、NA 1.2で水に浸します)、溶液に焦点が合うようにします。あるいは、ディッシュをサンプルホルダーに置き、サンプル(ディッシュの底から10〜20μm上など)に焦点を合わせます
注:水溶液サンプルの深部に焦点を合わせると得られる信号が弱いため、オイル対物レンズの使用はお勧めしません。
- 励起光路と発光路を設定します。たとえば、488 nmレーザー、488/561 nmダイクロイックミラー、検出ウィンドウ499-552 nm、ピンホールサイズ1エアリーユニット(AU)を選択します。ピンホールのサイズが、相互相関測定で使用されるものと同じであることを確認してください。
- ピンホールの位置(ピンホール調整)と対物カラーリングを調整して、カウント率を最大化します。この狙いを定めるには、最大カウントレートが検出されるまでカラーリングを回します。
手記：カラーリングの補正は、使用するカバーガラスの特定の厚さを考慮しています。カウントレートを最大化すること、つまり分子ごとにできるだけ多くの光子を収集することは、測定値の信号対雑音比(SNR)を最大化するために重要です。
- 相互相関測定で使用されるのと同じレーザー出力(通常は~1%、つまり~1〜2μW)で、一連のポイントFCS測定(たとえば、異なる場所で6回の測定を行い、それぞれが10秒、つまり合計時間2.5分、1μs以下の滞留時間でサンプリング)を実行します。
- トリプレット寄与(式1)を含む3次元拡散モデルをデータに当てはめます。
手記：通常、得られる拡散時間は約30μsで、構造因子は約4〜8です。
- 測定された平均拡散時間と、式 2.
に従って、室温での使用済み染料の拡散係数の公開値からウエスト w0 を計算します
一般的な値は200〜250nmです。
- 必要に応じて、2番目の検出チャンネル(561 nmの励起と570 nmから695 nmの間の検出など)に対して、異なる蛍光色素を使用してキャリブレーションルーチン(ステップ3.4〜3.9)を繰り返します。ピンホールの位置とサイズは、最初の検出チャネルに設定されたとおりにします。
- キャリブレーション測定値から分子輝度(式3)を計算し、取得した値を保存します。
手記：使用されるセットアップの一般的な値は、1.8 μW 488 nm の励起電力に対して ~8-10 kHz/分子 (MOL) です。通常よりも低い値は、対物レンズの汚れ、セットアップの位置ずれ、またはレーザー出力の低下を示している可能性があります。パワーメーターを使用して、対物レンズのレーザー出力パワーを定期的にチェックし、保存します。さまざまなセットアップを比較すると、励起レーザー出力で正規化された分子輝度が、顕微鏡の性能を評価するための最も意味のあるパラメーターです。
4. 走査型蛍光交差相関分光法:取得
>注:次のプロトコルは、この研究で使用したレーザー走査型共焦点顕微鏡でmEGFP/mEYFP(「緑」)およびmCherry/mCardinal(「赤」)を使用して行われた実験用に書かれています。光学セットアップとソフトウェア設定(レーザーライン、ダイクロイックミラー、フィルター)は、他のFPや顕微鏡のセットアップで異なる場合があります。
- 光路(488 nmおよび561 nmの励起と488/561 nmのダイクロイックミラー、488 nm励起用の1 AU上のピンホールなど)を設定します。スペクトルクロストークを回避するには、mEGFP/mEYFP(488 nm励起、緑チャネル)とmCherry/mCardinal(561 nm励起、赤チャネル)を連続して励起および検出する2つの別々のトラックを選択し、ラインごとにスイッチトラックを選択します。検出には、両方のチャネルに適切なフィルタを使用します(たとえば、緑チャネルで499〜552 nm、赤チャネルで570〜695 nm)。
- 交互励起が不可能な場合は、赤チャンネルの適切なフィルター設定を使用して、スペクトルクロストークを最小限に抑えます(つまり、600 nm以下のmCherry/mCardinal蛍光を検出します)。これにより、赤チャネルで検出される光子の量が減少し、SNRが低下する可能性があります。
- 混合細胞の入った皿をサンプルホルダーに置きます。温度平衡を確保し、フォーカスドリフトを減らすために、少なくとも10分待ちます。
- 「検索」メニューの透過ライトを使用してセルに焦点を合わせます。
- 互いに接触している「赤」と「緑」のセルのペアを検索します。正の相互相関またはホモダイマーの輝度制御(セクション2を参照)については、両方のチャネルで蛍光を発する単離された細胞、またはPM.
でそれぞれのホモダイマーシグナルを検索します。
注:(重要)細胞を検索する際のサンプル曝露を最小限に抑えて、相互相関を減らす可能性のある事前漂白を回避します。したがって、最速のスキャン速度で、低レーザー出力でスキャンします。強く発現する細胞をイメージングする際に検出器が飽和しないようにするには、統合モードで検索します。ただし、露出を最小限に抑えるために、フォトンカウンティングモードでは、より低いレーザー出力でのスキャンが可能です。
- 図1Bおよび図2Aに示すように、クロップボタンを使用して、細胞間接触(または正の相互相関またはホモダイマー輝度制御のための単一セルのPM)に垂直なスキャンパスを選択します< />
手記：一部の古い顕微鏡では、任意のスキャン方向が許可されていません。この場合、スキャン方向に垂直な向きの細胞間接触を配置する必要があります。
- ズームして50〜200 nmのピクセルサイズを実現し、スキャンモードでラインを選択します。フレーム サイズを 128 × 1 ピクセルに設定します。
手記：一般的なピクセルサイズは160nmで、スキャン長は約20μmに相当します。
- スキャン速度を最大許容値(例:472.73 μs per line.
)に設定します。
手記：別の励起方式の場合、これは954.45 μsのスキャン時間、つまり、使用したセットアップで~1000スキャン/秒に相当します。スキャン速度は、目的のタンパク質の拡散係数に応じて調整できます。メンブレンアンカータンパク質の場合、一般的な拡散時間は約10〜20ミリ秒です。スキャン時間は、拡散時間よりも少なくとも 10 倍短くする必要があります。スキャン速度が遅いと、光退色が強くなり、必要な照明パワーが低下する可能性があります。あるいは、Time SeriesサブメニューのIntervalを使用して、非常にゆっくりと拡散する複合体の各スキャンの間に、例えば5msの一時停止を課すこともできます。
- 適切なレーザー出力、例えば、488 nmの場合は~1-2 μW、561 nm励起の場合は~5-10 μWを選択します。
手記：レーザー出力が高いほどSNRは向上しますが、光退色は増加します。したがって、レーザー出力は、光退色が初期カウント率の50%未満になるように選択する必要があります。
- サイクルを 100,000-500,000.
に設定します
手記：スキャン回数、すなわち測定時間はさまざまです:測定時間が長いほどSNRが向上し、ゆっくりと拡散する分子により適している可能性がありますが、細胞の動きと光退色により最大測定時間が制限されます。ここに示されているデータは、通常、3~6分、つまり200,000〜400,000回のラインスキャンで取得されました。
- 検出器をフォトンカウンティングモードに設定します。[Start Experiment] を押して、取得を開始します。手順4.5〜4.11を繰り返して、別のセルを測定します.
手記：サンプルあたり10〜15個の細胞をさまざまな発現レベルで測定することをお勧めします。(クリティカル)高発現レベルでの検出器の飽和を避けてください。最大カウントレートは~1MHzを超えてはなりません。
- オリゴマー状態を決定するために輝度分析を行う場合は、修正されたステップ4.1-4.11に従ってホモダイマー輝度キャリブレーション測定を実施します:各蛍光タンパク質ホモダイマーを別々に測定し(単離された細胞で、プロトコルセクション2を使用して調製)、1つのスペクトルチャネルでのみ測定を行います。
