トランスフェクション細胞における酵素受容体相互作用を研究するための免疫沈降アッセイ

要約

出典:Strazza, M., et al.受容体と酵素の間の機能的相互作用を研究するための共免疫沈降アッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、抗GFP抗体でコーティングされたビーズを使用して、GFPタグ付き野生型および変異PD-1タンパク質の共免疫沈降を行う技術を示します。ビーズ結合したPD-1-GFPタンパク質は、PD-1と相互作用するSHP2タンパク質とインキュベートされ、SHP2の相互作用に重要な役割を果たすPD-1の特定の構造モチーフを同定することができます。

プロトコル

1. 免疫沈降

>注:次の手順は、氷上または4°Cで実行する必要があります。

1. 溶解バッファー(pH 7.2、250 mM NaCl、0.1% NP-40、2 mM EDTA、10%グリセロール)にプロテアーゼ阻害剤(1 錠剤を10 mLの溶解バッファーに溶解)および1 mMオルトバナジン酸ナトリウムを添加します。500 μLの氷冷溶解バッファーを細胞に加え、細胞スクレーパーを使用してすぐにプレートから細胞を取り出して回収します。
   手記： オルトバナジン酸ナトリウムは、SHP2-トランスフェクトプレートおよび非トランスフェクトコントロールプレートはホスファターゼ活性を保持する必要があるため、PD-1-GFPトランスフェクトプレートに使用される溶解バッファーにのみ添加することが重要です。
2. ライセートを1.5 mLのコールドチューブに移し、0.005 x g、4°Cで30分間回転させます。
3. ライセートから後核上清(PNS)を回収するには、ライセートを10,000 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を新しいチューブに移します。ペレットを捨てます。6 枚のプレートからなる 2 番目のセット(図 1)の上清を氷上に保存し、後で全細胞ライセート分析を行います。
4. 最初のセット(4つのプレート)のPD-1-GFPトランスフェクトライセートからのPD-1-GFPの免疫沈降のための抗GFPビーズの調製(図1)。
   1. ビーズの沈降を防ぐため、開封前にボトルをビーズで軽く振ってください。各条件ごとに40 μLの抗GFPビーズをスラリーから取り除きます。
   2. 500 x gで4°Cで3分間遠心し、上清を取り除いてビーズを洗浄します
      手記：紛失を防ぐために、ピペットのプラスチックチップとアガロースビーズの接触を最小限に抑えることが重要です。ビーズを別のチューブに移す前に、200 μLのチップの端を切断することをお勧めします。
   3. ビーズを80 μLの溶解バッファー(サンプルあたり)に再懸濁します。
5. 洗浄したビーズを、最初のセット(4枚のプレート)のPD-1-GFP発現細胞の細胞ライセート(PNS)に直接加えます(ステップ1.3)。0.005 x gで4°Cで30分間回転させ、GFPタグ付きタンパク質を免疫沈降させます。
6. ビーズを1 mLの冷溶解バッファー(オルトバナジン酸なし)で3回洗浄します。チューブを2,500 x gで10 s.
   で遠心分離します。 手記：ビーズに溶解バッファーを添加する場合は、チップでビーズに触れずにビーズに直接添加してください。洗浄中にピペットで上下させる必要はありません。
7. 同様に、活性型SHP2のライセートを最初のセット(1枚のプレート、ステップ1.3)から分割し、洗浄したPD-1-GFP含有ビーズ(WT PD-1-GFPと2つの異なるリン酸化欠損変異、Y223FおよびY248F)の3本のチューブに加えます。トランスフェクションしていない細胞のライセートからWT PD-1-GFPビーズの2本目のチューブに3分の1の容量を加えます。残りの3分の2を捨てます。
8. ビーズを4°Cで4時間インキュベートし、穏やかに回転させます(0.005 x g)。
9. ステップ1.6で報告したように、ビーズを1 mLの冷溶解バッファー(パーバナジン酸またはオルソバナジン酸を含まない)で2回洗浄します。
10. サンプルあたり80 μLの溶解バッファー(ペルバナジン酸またはオルソバナジン酸なし)を添加し、各チューブ内の総容量が100 μL(ビーズ20 μLおよび溶解バッファー80 μL)になるようにします。穏やかに混合し、各チューブから50 μLを2本の新鮮な1.5 mLチューブに移します
    手記：このステップに続いて、ビーズと溶解バッファーを含む混合物で満たされた2本のチューブがあります。チューブの 1 つは、ウェスタンブロッティングによる共免疫沈降 SHP2 の試験に使用されます。

2. SHP2ウェスタンブロット解析

1. ビーズを回転させ、上清を取り除きます。
2. 20 μLの2x Laemmli buffer(材料表を参照)をビーズに加え、95°Cで5分間煮沸します。
3. BCAキットを使用して、インプットコントロール(2番目のセット)のタンパク質濃度を測定します(材料表を参照)。最も希釈したサンプル30μLを新しいチューブに移します。残りのインプットコントロールを溶解バッファーで最も希釈したサンプルと同じ濃度に希釈し、各コントロールから30 μLを新しいチューブに移します
   手記：このステップに続いて、それぞれ30 μLのチューブが4本あり、同様のタンパク質濃度で、インプットコントロールライセートを表します。
4. 等量の2x Laemmli bufferをライセートに加え、95°Cで5分間煮沸し、ビーズをスピンダウンし、上清を4-20% SDS-PAGEトリスベースのゲル(材料表を参照)にロードしてウェスタンブロット分析を行います。さらに、2番目のセットの各サンプルから50μLをロードします。
5. ウェスタンブロット解析を続行します。

結果

図1:実験条件と戦略。HEK 293T細胞においてGFP-PD-1 WT(野生型)、GFP-PD-1 Y223F(ITIM変異体)、またはGFP-PD-1 Y248F(ITSM変異体)を発現させ、その後、パーバナジントで処理しました。GFP免疫沈降法により採取したリン酸化GFP-PD-1タンパク質を、SHP2を過剰発現する細胞由来のライセートと混合し、PD-1の各バージョンに結合したSHP2のレベルと活性を記録しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ニトロセルロースメンブレン	ゼネラル・エレクトリック	10600004
マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	5424-R	1.5ミリリットル
ビーシー	漁夫	23225	Bi Cinchoninic Acidアッセイ
アンチSHP2	サンタクルス	SC-280
抗GFPアガロース	MBLの	D153-8
アンチGFP	ロシュ	118144600
アンチアクチン	サンタクルス	SC-1616
HEK-293細胞	ATCCの	CRL-1573
オルソバナデート	シグマ	S6508
プロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11836170001	EDTAフリー
Tris-Glycine SDS サンプルバッファー (2x)	インビトゲン	LC2676	修正された Laemmli バッファー
4-20% トリス-グリシンミニゲル	インビトゲン	XP04205BOX	15ウェル
トリプシン-EDTA(0.25%)フェノールレッド	ギブコ	25200114
NaCl	シグマ	S7653	塩化ナトリウム

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