ELISAを用いたベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用解析法

要約

出典: Singh, B. et al., Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、固定化された最初のタンパク質への2番目のタンパク質の結合を測定することにより、2つのタンパク質間のタンパク質間相互作用を検出するELISAベースの技術について説明しています。結合した第2のタンパク質は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で標識された特異的抗体を使用して検出されます。

プロトコル

1. 組換えPHとVnの相互作用のELISA解析

>注: 非特定のバインディングを除外するには、コントロールを含める必要があります。ヒト因子H(FH)またはC4b結合タンパク質(C4BP)をそれぞれ陽性および陰性のコントロールとして使用します。

1. 各ヒトタンパク質(Vn、FH、およびC4BP)をTris-HCl、pH 9.0(コーティングバッファー)で50 nMに個別に希釈します。100 μLのタンパク質溶液をPolysopマイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。プレートを蓋で閉じ、4°Cで一晩(16時間)保存して、タンパク質のマイクロタイタープレートウェルへの固定化を促進します。
2. マイクロタイタープレートから溶液をシンクの上で逆さまに傾けて廃棄し、ウェルを300μLのPBS/ウェルで3回洗浄します。コーティングされたウェルを、2.5%(w / v)BSA(PBS-BSA)を含むPBSでRTで1時間ブロックします。
3. ブロッキング溶液を除去した後、ウェルあたり0.05%(v/v)Tween 20(PBST)を含むPBS300μLでウェルを3回洗浄します。50 nM組換えHisタグ付きPHを100 μLを各サンプルウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。コントロールウェルでは、PBS-BSAを100 μLだけ添加します
   手記：Hif由来のPHをコードするlph遺伝子をPCRで増幅し、発現タンパク質のC末端に6× Hisタグを付加するpET26b発現ベクターにクローニングしました。組換えベクターを大腸菌BL21(DE3)に変換して発現させました。Ni-NTA樹脂を使用して、組換えタンパク質を精製しました。
4. タンパク質溶液を廃棄し、ウェルごとに300μLのPBSTでウェルを3回洗浄することにより、結合していないタンパク質を除去します。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗His pAbs(1:10,000希釈)を含むPBS-BSA100 μLを添加し、室温で1時間インキュベー
トします。
5. テトラメチルベンジジンを5%アセトンと45%メタノールの溶液に溶解して、20 mM溶液Aを調製します。溶液Bを調製するには、19.2 gのクエン酸を1,000 mLの_H2Oに溶解し、KOHを添加してpHを4.25に調整し、さらに230 μLの30%_H2O2を加えます。両方の溶液は、RTで暗闇の中で保管してください。使用直前に、500 μLの溶液Bと9.5 mLの溶液Aを混合して、ELISA検出試薬を調製します。
6. ウェルを300 μLのPBSTでウェルを3回洗浄し、各ウェルに100 μLのELISA検出試薬を添加して抗原-抗体複合体を検出します。
7. 1 M H₂SO₄/wellを50 μL加えて反応を停止します。マイクロプレートリーダーを使用して、450 nmでのウェルの光学密度を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AR2Gセンサー	ポール・ライフサイエンス	〒18-5095	アミノカップリングによる固定化タンパク質へのセンサー
アセトン	VWRの	97064-786	分析グレード
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A2058(英語版)	細胞培養に適しています
C4BP(C4b結合タンパク質)	Complement Technology, Inc. (英語)	A109(日本語	冷凍液体の形で購入
クエン酸	シグマ・アルドリッチ	251275から500G	米国化学会(ACS)グレード
HRP標識抗Hisタグ抗体	アブカム	AB1269 (英語	ポリクローナル
C4BP	Complement Technology, Inc. (英語)	A109(日本語	冷凍ソリューション
ヒスチジンアフィニティー樹脂カラム(HisTrap HP)	GEヘルスケアライフサイエンス	17-5247-01	Niセファロースを充填済みカラム
Hisタグ付きPH			私たちの研究室で組換え発現および精製
メタノ	VWRの	BDH1135-1LP	分析グレード
骨格上にC末端6x Hisタグを含むプラスミド(pET26(b))	ノヴァゲン	69862から3	DNAベクター
ポリソルブマイクロタイタープレート	シグマ・アルドリッチ	M9410	ELISAの場合
テトラメチルベンジジン	シグマ・アルドリッチ	860336から100MG	ELISAグレード
ヒト血漿由来のビトロネクチン(Vn)	シグマ・アルドリッチ	V8379-50UG	細胞培養グレード

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