β-ラクタマーゼを用いたタンパク質間相互作用のための伝導性バイオセンサーアッセイ

要約

出典: Vandevenne, M., et al. 生体分子相互作用を検出するためのβ-ラクタマーゼベースの伝導性バイオセンサーアッセイの使用. J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、トランスデューサーチップに固定化された標的抗原と抗体との相互作用を研究するための導電率測定バイオセンサーアッセイを実演しています。バイオセンサーは、二官能性キメラタンパク質(機能的な触媒部位を持つβ-ラクタマーゼ酵素で、固定化された標的抗原に結合するためのナノボディに融合するように設計されています。結合すると、β-ラクタマーゼ酵素による抗生物質基質の触媒加水分解により電気信号が生成され、抗原と抗体の相互作用が確認されます。

プロトコル

1. タンパク質サンプル調製

1. 以前の研究で報告されているように、ハイブリッドタンパク質BlaP-cAb-Lys3を産生および精製します。タンパク質を50mMリン酸緩衝液pH 7.4に以下の組成で保存する:NaCl 8g、KCl0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、およびKH₂PO 40.24gを800mLの蒸留水に溶解し、溶液のpHを7.4に固定してから、溶液の最終容量を1 Lに調整する。
2. 鶏卵白リゾチーム(HEWL)ストック溶液を準備します。市販のHEWL 100 mg(40,000 units/mg)をリン酸緩衝生理食塩水10 mLに溶解します(PBSはステップ2.1.1を参照)。0.22 μmのカットオフフィルターを使用してろ過することにより、タンパク質溶液を滅菌します。

2. バイオセンサーアッセイ

1. 溶液とバッファーの調製
   1. 8 gのNaCl、0.2 gのKCl、1.44 gのNa₂HPO₄、および0.24 gのKH₂PO₄を800 mLの蒸留水に溶解して、50 mM PBSを調製します。溶液の量を1 Lに調整する前に、1 N HClまたは1 N NaOHでpH 7.4に調整します。
   2. 上記のように調製したPBS100 mLに3 gのカゼイン加水分解物を溶解することにより、飽和/ブロッキング溶液を調製します(ステップ2.1.1を参照)。フィルター滅菌し、4°Cで保存します。
   3. 上記のように調製したPBS100 mLに1 gのカゼイン加水分解物を溶解して、結合溶液を調製します(ステップ2.1.1を参照)。フィルター滅菌し、4°Cで保存します。
   4. 上記のように調製したPBS100 mLにTween 20(100%)100 μLを加えて、洗浄液(0.1% Tween - PBS)を調製します(ステップ2.1.1を参照)。4°Cで保存してください。
   5. 上記のように調製したPBS100 mLにTriton X-100 mL(100%)を添加し、電極調製溶液(1% Triton X-100 - PBS)を調製します(ステップ2.1.1を参照)。4°Cで保存してください。
   6. 26 gのKClを蒸留水に溶解して、最終容量100 mLまで電極再生溶液(3.5 M KCl)を調製します。フィルター滅菌し、4°Cで保存します。
   7. 0.29 gのNaClを蒸留水に溶解して5 mM NaCl溶液を調製し、最終容量の1 Lにろ過して滅菌し、4°Cで保存します。次に、26.7 mgのベンジルペニシリンを20 mLの5 mM NaCl溶液に溶解して、検出溶液(4 mMベンジルペニシリン)を調製します。フィルター滅菌し、-20°Cで保存します。
2. センサーの準備と再生
   手記：ポリアニリンコーティングされたセンサーチップは、P. Bogaerts博士、S. Yunus博士、Y. Glupczynski教授(ルーヴァン・ラ・ヌーヴ・カトリック大学 - CHU Mont-Godinne)によって開発され、提供されました。センサーの説明と、これらのセンサーを合成するために使用されるポリアニリン電気重合プロトコルについては、以前の研究で詳しく説明しています。簡単に言うと、このシステムは、従来のプリント回路基板(PCB)技術によって製造された8つの個別のチップの再利用可能なセンサーを使用します。個々のチップは、3つの電極丸いスポットで構成されています。一番上のものは、ポリアニリンを電気合成した作用電極です。真ん中の電極が参照電極で、下の電極が対電極を構成しています。基準電極と対極はどちらも、炭素層の上に固体Ag/AgClアマルガムを使用して官能化されています。
   1. 300 μL/ウェルの電極調製溶液(1% Triton X-100 - PBS、ステップ2.1.5.を参照)を含む96ウェルプレートのウェルにチップを浸して、電極を3回洗浄します。室温で穏やかに混合しながら、各洗浄を2分間行います。
   2. 300 μL/ウェルの蒸留水が入った96ウェルプレートのウェルにチップを浸し、室温で穏やかに混合しながら2分間電極をすすぎます。
   3. 300 μL/ウェルの再生溶液(3.5 M KCl、ステップ2.1.6を参照)を入れた96ウェルプレートのウェルにチップを浸し、室温で4°Cまたは1時間で一晩浸して電極を再生します。
   4. 300 μL/ウェルのリン酸緩衝生理食塩水を含む96ウェルプレートのウェルにチップを浸すことにより、電極を3回洗浄します(ステップ2.1.1を参照)。室温で穏やかに混合しながら、各洗浄を2分間行います。
3. センサーで実施された結合アッセイ
   1. PBSで調製した40μg/mLのHEWLを15μL滴下して電極表面にHEWLを塗布することにより、電極のPANI(ポリアニリン)表面にHEWLをコーティングします。4°Cで一晩、または室温で1時間インキュベートします。
   2. センサーチップの電極部分を300 μL/ウェルのリン酸緩衝生理食塩水を含む96ウェルプレートのウェルに浸すことにより、電極をリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します(ステップ2.1.1を参照)。室温で穏やかに混合しながら、各洗浄を2分間行います。
   3. 電極表面にブロッキング溶液(ステップ2.1.2を参照)を50μL滴加えて電極を飽和させます。室温で1時間インキュベートします。次に、前の手順で説明したように3回洗います(手順2.3.2を参照)。
   4. BlaP-cAb-Lys3溶液を結合溶液中で20 μg/mLに希釈し(ステップ2.1.3を参照)、この希釈溶液を15 μL滴下して電極に塗布します。室温で10分間インキュベートします。抗原-ナノボディ反応後、前のステップで説明したように、洗浄液を使用して3回洗浄します(ステップ2.1.4を参照)。次に、電極をPBSで一度すすぎます(ステップ2.1.1を参照)。
   5. 検出するには、センサーチップを銅回路部分を介してデジタルマルチメータに差し込みます。次に、50 μL滴の検出溶液(ステップ2.1.7を参照)を正極に塗布し、50 μL滴のNaCl 5 mM溶液を負極に塗布してセンサー応答を開始します(ステップ2.1.7を参照)。室温で30分間インキュベートします。デジタルマルチメータでコンダクタンスを監視します.
      手記：マルチメータは、P. Bogaerts博士、S. Yunus博士、Y. Glupczynski教授(Catholic University of Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne.このポテンショスタットは、USBポートを介してコンピュータ制御され、センサーの8つの異なるチップを同時に分析します。Yunusらが作成したソフトウェアは、参照電極とサンプル電極の間のコンダクタンス差の時間に対する測定値を表すリアルタイムプロットを作成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
KH2PO4	シグマ・アルドリッチ	V000225
K2HPO4	シグマ・アルドリッチ	1551128
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S7653
トリス-HCl	ロシュ	10812846001
EDTAの	シグマ・アルドリッチ	E9884
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9541
Na2HPO4	シグマ・アルドリッチ	NIST2186II
2-メルカプトエタノール	シグマ・アルドリッチ	M6250
アラニン	シグマ・アルドリッチ	A7627
HClO4	フルーカ	34288	1M HClO4溶液、ディストリビューター:Sigma-Aldrich
カゼイン加水分解物	シグマ・アルドリッチ	22090
ベンジルペニシリンナトリウム	シグマ・アルドリッチ	B0900000
鶏卵白リゾチーム	ロシュ	10837059001
ヘプタン	シグマ・アルドリッチ	246654
メタノール	シグマ・アルドリッチ	322415
水酸化アンモニウム溶液	シグマ・アルドリッチ	380539	H2O中の28%NH3、再蒸留により精製(濃縮?
ラボ用消耗品
6ウェルプレート	グライナーバイオワン	657165	CELLSTAR 6ウェルプレート
備品
pHメーター	WTWの	1AA110	ラボ用pHメーター inoLab pH 7110
真空およびろ過システム	ナルゲン	NALG300-4100	受信機・分配器付フィルターホルダー:VWR
ポテンショメトリックセンサーチップ			ユヌスらによる製造(参考文献16)
PGSTAT30オートラボ	メトロームオートラボ		生産終了、後継機オートラボPGSTAT302N
デジタルマルチメータ METRAHit 22M	ゴッセン・メトラワット		生産終了、後継機種 Metrahit Base

の 型