タンパク質間相互作用を検出するためのビオチン化細胞透過性ペプチドプローブ

要約

出典: Jaraíz-Rodríguez, M. et al., Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-Protein, Interactions. J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、ビオチン化細胞透過性ペプチドを使用して細胞内のタンパク質間相互作用を検出する技術を示しています。細胞透過性ペプチドは、結合ペプチドが細胞内に侵入し、その相互作用タンパク質に特異的に結合するのを促進します。ビオチンは、アビジンに結合した後、細胞溶解物から相互作用するタンパク質の複合体を精製することができます。

プロトコル

1. セル

1. 手順を開始する2日前に、実験当日に必要な密度で細胞をプレート化します。細胞をフラスコまたはプレートに播種します。ただし、プレートからのタンパク質抽出は容易になります。1回の実験につき、1条件につき78cm2のプレートを少なくとも4枚、または150cm2のフラスコを2枚用意しておくと、結果が一貫していることを確認することができます。
2. この研究では、150 cm²の4つのフラスコでヒトG166 GSCをプレート化し、2% B27、1% N2、20 ng/mL EGF、およびb-FGFを添加したRHB-A幹細胞培地で培養しました。合流点に達したときのプロセス。例えば、5 x 10⁶ G166細胞を150 cm²フラスコに播種した場合、播種2日後に処理しました。

2. ビオチン化CPP

1. 凍結乾燥ビオチン化CPP(BCPP)を含むバイアルを8200 x gで30秒間回転させ、蓋に粉末の一部が残らないようにします。コントロールBCPPを含めて、検出された相互作用がターゲット配列に特異的であることを確認します。本研究では、コントロールBCPPはTATビオチン(TAT-B)、治療BCPPはTAT-Cx43_266-283-Bとした。ビオチンに結合したスクランブルまたは変異したフラグメントに融合したTATなど、他のコントロールを使用することもできます。
2. BCPPsを対応する培地にメーカーが示したストック溶液に溶解します。例えば、GSCを処理するための2 mg/mL BCPPのストック溶液を得るためには、1 mgのBCPPを含む1バイアルに0.5 mLのGSC培地を添加します。ボルテックスし、ペプチドが十分に溶解していることを確認します。

3. チューブ

>注:セクションで必要な条件ごとに少なくとも1.5 mLチューブを12本準備します

1. 条件ごとに最初の3本のチューブをマークします。それらは、ステップ6.4で得られた細胞ライセートの総量を有することになる。
2. 条件ごとに3本のチューブにAをマークします。これらのチューブには、細胞溶解物を溶解して回転させた後に得られる最初の上清があります(ステップ7.2)。
3. 条件ごとに3本のチューブでBをマークします。これらのチューブには、最初の上清の小さなアリコートがあります。これらのライセートは、ステップ7.3のウェスタンブロットサンプルとして機能します。
4. 条件ごとに3本のチューブにCをマークします。これらのチューブには、ニュートラアビジンによるプルダウン後に得られる上清が含まれます (ステップ 7.7.
   手記： これは、ウェスタンブロットがタンパク質のシグナルを示さなかった場合、つまり、手順のある段階でタンパク質が引き下げられなかったか、失われた場合に重要です。このような場合は、タンパク質を引き下げるプロセスを繰り返してください。

4. BCPPによる細胞治療

1. 培地を吸引します。
2. BCPPをインキュベーションするために必要な新鮮な培地を、インキュベーション時間に応じて可能な限り少ない量の培地に交換してください。いずれにせよ、細胞が乾燥しないように、培地がプレート/フラスコの全面を完全に覆うことが非常に重要です(たとえば、30分間のインキュベーションで150 cm²あたり6 mL
)。
3. BCPPのストック溶液の量を細胞培養物に加えて、有効性が証明されている濃度に到達します。この研究では、50 μM TAT-Cx43266-283-B が GSC の増殖を抑制することが証明されました。
   1. したがって、培地1 mLあたり92.8 μLの2 mg/mL TAT-Cx43_266-283-B(MW=3723.34 g/mol)を添加すると、最終濃度は50 μM TAT-Cx43_266-283-Bになります。コントロールペプチドで添加する容量が異なる場合は、最終容量が同じになるまで培地をご用意ください。例えば、培地1 mLあたり49.1 μL TAT-B(MW=1914.31 g/mol)と43.7 μL GSC培地を添加すると、最終濃度は50 μM TAT-Bになりました。
4. 細胞をインキュベーターに37°C、5%CO₂で30分間置き、BCPPとその細胞内パートナーとの間の相互作用が起こることを確認します。相互作用に時間がかかる場合は、インキュベート時間を長くするか、実験が時間経過で構成されている場合は時間を調整します。さらに、目的の相互作用は、異なる細胞内シグナル伝達経路を刺激することにより、促進または防止することができます。

5. バッファと解決策

1. PBS pH 7.4を調製します:136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na₂HPO₄·2H₂O; 1.7 mM KH₂PO₄.
2. タンパク質溶解バッファーを調製します:20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、137 mM NaCl、1% IGEPAL、使用前に、以下を追加してください:1/100(v / v)プロテアーゼ阻害剤カクテル、1 mMフッ化ナトリウム、1 mMフェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)、および0.1 mMオルトバナジン酸ナトリウム。
3. Laemmli バッファーを調製します: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M グリセロール; 3.7 % SDS (p/v); 0.6 M β-メルカプトエタノールまたは 9 mM DTT; 0.04 % (v/v) ブロモフェノールブルー (BB)) を調製します。

6. タンパク質抽出

>注:タンパク質抽出は前述のように行われました。この手順のセクション全体を4°Cで実行します。

1. 培地を完全に吸引します。
2. 細胞の剥離を避けるために、150 cm²あたり氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3 x 10 mLを非常に注意深く洗浄します。
3. 細胞溶解物を得るためには、150 cm²あたり3 mLの溶解緩衝液を添加し、細胞スクレーパーを用いて表面を徹底的に掻き取ります。プレート/フラスコを約45度に傾けると、細胞ライセートを対応するチューブに集めやすくなります。
4. チューブあたり1 mLの細胞ライセートを3本の1.5 mLチューブに注ぎます。これらのチューブには、ステップ3.1で示された条件と複製がマークされます。

7. プルダウン

1. 1.5 mLチューブを11,000 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
2. 上清を新しいチューブ(A)に移します。
3. この上清を条件ごとに異なるチューブ(B)、つまりチューブあたり50μLにアリコートを取ります。4x Laemmli バッファー (50 μL のライセートに対して 16.6 μL) を加え、-20 °C で凍結します。これらのライセートは、通常のウェスタンブロットサンプルとして機能します。
4. NeutrAvidin Agaroseを穏やかに振って非常によく均質化します。ピペットチップの先端をカットして直径を大きくし、ビーズのピペッティングを改善します。(A)チューブ内の細胞溶解物1 mLあたり50 μLのニュートラアビジンアガロースを添加します。
5. 4°Cで一晩インキュベートし、非常に穏やかに振とうして、NeutrAvidinが細胞内パートナーに結合したBCPPと相互作用できるようにします。
6. 3,000 x gで1分間、4°Cで遠心分離し、ニュートラアビジンとタンパク質との複合体を収集します。
7. 上清を慎重に取り除き、きれいなチューブに移します(C)。プルダウンが成功しなかった場合に備えて、それらを保管
しておいてください。
8. 洗浄ステップ:ペレット(チューブA)に新鮮な溶解バッファーを追加し、反転して再懸濁し、ステップ7.6と7.7をさらに5回繰り返します。これらの上清はすべて捨てることができます。
9. 上清を除去し、2x Laemmli バッファーを目的の最終容量に加えます (コンフルエント細胞の cm² フラスコから得られるペレットの場合は、1.5 mL チューブあたり 40 μL です)。
10. 100°Cで5分間溶出させてタンパク質間の相互作用を解離させ、8,200 x gで30秒間遠心分離してNeutrAvidinビーズをペレット化します。
11. 解離したタンパク質を含む上清を、毛細血管の先端を新しいチューブに取ります(D)。ビーズは、溶出ステップを繰り返す必要がある場合に備えて保管できます.
    手記：これで、上清(チューブD)をウェスタンブロットにロードするか、-20°Cで凍結する準備が整いました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
G166 GSCライン	バイオレップ
RHB-A幹細胞培地	タカラ	40001円
ラミニンマウスタンパク質	Invitrogen、ライフテクノロジーズ、サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017-015	10μg/ミリリットル
B-27 無血清サプリメント (50X)	Invitrogen、ライフテクノロジーズ、サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504-044	2%
N-2サプリメント(100x)	Invitrogen、ライフテクノロジーズ、サーモフィッシャーサイエンティフィック	17502-048	1%
組換えヒトEGF	ペプロテック	AF-100-15	20 ng/ml
組換えヒトb-FGF	ペプロテック	AF-100-18B	20 ng/ml
PBS pH 7.4: 脱イオン水中、136 mM NaCl、2.7 mM KCl、7.8 mM Na2HPO4·2H2O、1.7 mM KH2PO4
TAT	ジェンスクリプト		オーダーメイド
TAT-Bの	ジェンスクリプト		オーダーメイド
TAT-CX43266-283	ジェンスクリプト		オーダーメイド
TAT-CX43266-283-B	ジェンスクリプト		オーダーメイド
Pierce™ Neutrアビジン™アガロース	サーモフィッシャーサイエンティフィック	29200
タンパク質溶解バッファー:5 mM Tris HCl (pH 6.8)、2% (w/v) SDS、2 mM EDTA 、2 mM EGTA
フッ化ナトリウム	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	141675	1 mM
フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)	シグマ・アルドリッチ	P7626	1 mM
オルトバナジン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S6508	0.1 mM
Laemmli バッファー: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M グリセロール; 3.7 % (w/ v) SDS; 0.6 M β-メルカプトエタノールまたは 9 mM DTT; 0.04% (v/v) ブロモフェノールブルー (BB) .

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