酵母細胞におけるタンパク質自己会合を決定するための酵母2ハイブリッドアッセイ

要約

出典: Stanczyk, P. J., et al., Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、特定のタンパク質の自己相互作用を検出するための酵母2ハイブリッドアッセイを実演しています。このアッセイでは、目的のタンパク質は、β-ガラクトシダーゼ酵素をコードする転写因子の2つのドメインにタグ付けされます。2つのタンパク質が相互作用すると、転写と翻訳が酵素を形成し、生化学的アッセイを使用して検出されます。

プロトコル

1. 酵母の変換

1. 1,500 x gで5分間、RTで遠心分離(50 mLチューブ内)により酵母を回収し、上清を廃棄し、各ペレットを5 mlの滅菌H₂Oに再懸濁し、一緒にプールします。
2. 1,500 x gでRTで5分間再遠心分離し、上清を捨てます。酵母ペレットを調製したばかりの滅菌済み1x LiAc/TE.
   1 mLに再懸濁します。 手記：調製から1時間以内にコンピテント酵母細胞を使用してください。
3. プラスミドサンプル(1.5 mLチューブ内)を調製するには、単回形質転換の場合は200 ngのプラスミドDNAを、共形質転換の場合は各プラスミドDNAを0.5 - 1 μg、ニシン精巣キャリアDNA100 μg(20分間煮沸し、使用直前に氷上で冷却)を加えて調製します。
   注:ポジティブコントロール、例えば、pVA3(p53タンパク質とのGAL4 DNA-BD融合のコード化)およびpTD1(SV40大T抗原とのGAL4 AD融合のコード化)と共形質転換した酵母を含む。
4. 調製したばかりの有能な酵母懸濁液100 μlと1x LiAc/PEG溶液600 μl(ストックPEG 3350 8 ml、ストックTE 1 ml、ストックLiAc 1 ml)を加え、ボルテックスで~30秒間ボルテックスし、200 rpmで振とうしながら30°Cで30分間インキュベー
トします。
5. 80 μlのジメチルスルホキシド (10% v/v 最終濃度) を加え、穏やかに反転させてよく混合します。42°Cのウォーターバスで15分間ヒートショックを行い、2〜3分ごとに混合します。
6. 細胞懸濁液を氷上で2分間冷却し、RTで14,000 x gで15秒間遠心分離して酵母を回収します。
7. 細胞ペレットを1x TEの100 μLに再懸濁し、選択的増殖のために適切な最小SD培地プレートにプレートします(ベイトとターゲットプラスミドの両方に選択圧力を保つためにロイシンとトリプトファンが不足している培地)。
8. プレートを30°Cで逆さまにしてインキュベートし、コロニーの直径が~2 mmになるまで(通常は4〜5日)インキュベートします。プレートは4°Cで2〜3週間保存できます。長期間保存する場合は、グリセロールストックを作成し、-80°C.
   で保存します。 手記： ベイトタンパク質と標的タンパク質がイムノブロッティングにより酵母で発現していること、および酵母で別々に発現した場合に自律的なレポーター遺伝子の活性化を持たないことを検証します。
9. 調製したばかりの有能な酵母懸濁液100 μlと1x LiAc/PEG溶液600 μl(ストックPEG 3350 8 ml、ストックTE 1 ml、ストックLiAc 1 ml)を加え、ボルテックスで~30秒間ボルテックスし、200 rpmで振とうしながら30°Cで30分間インキュベー
トします。
10. 80 μlのジメチルスルホキシド (10% v/v 最終濃度) を加え、穏やかに反転させてよく混合します。42°Cのウォーターバスで15分間ヒートショックを行い、2〜3分ごとに混合します。
11. 細胞懸濁液を氷上で2分間冷却し、RTで14,000 x gで15秒間遠心分離して酵母を回収します。
12. 細胞ペレットを1x TEの100 μLに再懸濁し、選択的増殖のために適切な最小SD培地プレートにプレートします(ベイトとターゲットプラスミドの両方に選択圧力を保つためにロイシンとトリプトファンが不足している培地)。
13. プレートを30°Cで逆さまにしてインキュベートし、コロニーの直径が~2 mmになるまで(通常は4〜5日)インキュベートします。プレートは4°Cで2〜3週間保存できます。長期間保存する場合は、グリセロールストックを作成し、-80°C.
    で保存します。 注:ベイトタンパク質と標的タンパク質がイムノブロッティングによって酵母で発現していること、および酵母で別々に発現した場合に自律的なレポーター遺伝子の活性化がないことを確認してお
いてください。

2. コロニーリフトフィルターペーパー β-Gal アッセイ

1. 次のバッファーを準備します。
   1. 100 mM Na₂HPO₄、40 mM NaH₂PO₄、10 mM KCl、および 1 mM MgSO₄ を含む Z バッファーを調製し、pH を 7.4 に調整します。オートクレーブ滅菌し、RTで保存します。
   2. N,N-ジメチルホルムアミド中の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを20 mg/mlで溶解し、-20°Cで暗所で保存してX-Gal緩衝液を調製します。ZバッファーにX-Galを0.33 mg/mL、β-メルカプトエタノールを0.27% v/vで混合して、使用前にバッファーを作製してください。サンプルあたり2.5mlを使用してください。
2. 調製したばかりのZバッファー/X-Gal溶液2.5 mLを清潔な100 mmプレートに加え、セルロースフィルターペーパーの中に置きます。
3. 新しい濾紙をプレートの表面に置き、分析する酵母コロニーを入れます。鉗子で濾紙をプレートにそっとこすりつけ、コロニーが付着するまで~5分間放置します><。 手記：ポジティブコントロール、すなわち、pVA3およびpTD1と共形質転換した酵母を並行して処理します。
4. 濾紙を持ち上げ、液体窒素のプールに(鉗子を使用して)30秒間沈めます(液体窒素の取り扱いには注意が必要です。常に厚い手袋とゴーグルを着用してください)。凍らせた濾紙をRTで~2分間解凍します。
5. 100 mmプレート内の予備に浸した濾紙の上に濾紙(コロニー側を上にして)を置き、30°Cでインキュベー
トします。
6. 定期的に(~30分おきに)青いコロニーの出現を確認してください.
   手記： 弱い餌:ターゲットの相互作用が陽性の青色シグナルを生成するまでに数時間かかる場合があります(偽陽性の結果をもたらす可能性のある長時間のインキュベーション(>8時間)は避けてください)。最良の結果を得るには、新たに共形質転換したコロニー、すなわち、30°Cで4〜5日間、直径~2mmで増殖させたコロニーを使用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プレートインキュベーター	ヘロース	B6120	デバイス
オービタルシェーカーインキュベーター	ニューブランズウィックサイエンティフィック	イノーバ4300	デバイス
分光 光度 計	パーキン・エルマー	ラムダバイオ+	デバイス
マッチメーカー 2ハイブリッドシステム 2キット	タカラクロンテック	K1604-1	餌ベクトルpGBKT7、獲物ベクトルpACT2および酵母株Y190が含まれています
酵母窒素ベース	シグマ・アルドリッチ	0626年度	最小限のSD成長培地を準備するには
ロイシンとトリプトファンを欠いたドロップアウトサプリメント	シグマ・アルドリッチ	0750円	最小限のSD成長培地を準備するには
ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンを欠くドロップアウトサプリメント	シグマ・アルドリッチ	2001年度	最小限のSD成長培地を準備するには
ニシン精巣キャリアDNA	タカラクロンテック	630440	酵母の形質転換に
Whatman濾紙グレード5	シグマ・アルドリッチ	WHA1005070	コロニーリフト濾紙β-Galアッセイに使用
X-Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)	シグマ・アルドリッチ	B4252	コロニーリフト濾紙β-Galアッセイに使用