タンパク質間相互作用を研究するためのタンデムアフィニティー精製アッセイ

要約

出典:Ma, Z., et al.真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、タンデムアフィニティー精製 - 真核細胞からタンパク質複合体を精製してタンパク質間相互作用を研究する技術を示しています。この複合体には、異なるエピトープタグで標識された2つのタンパク質が含まれています。2つの異なるタグに親和性を持つ2つの樹脂を用いて錯体を順次精製すると、溶出中に両方のタンパク質が存在することから、2つの間の相互作用が確認されます。

プロトコル

1. めっきセル

1. トランスフェクションの1日前に、100 mm皿あたり10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U / mlストック)を補充した10 mLのダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)に3.5 x 10⁶ HEK293T細胞をプレートします。プレート3 - 5 100 mm 100 mm¹つの実験/条件ごとに2皿で十分なタンパク質回収を確保します.
   手記： プレートの数は、実験/条件ごとに決定する必要があり、これは目的のタンパク質複合体の発現レベルと溶解度に依存します。あるいは、より大規模な精製が必要な場合は、スピナーフラスコ内の懸濁液中で細胞株を増殖させることができますが、この方法は一過性トランスフェクションには適していません。

2. 細胞のトランスフェクションまたは安定細胞株の誘導

1. 翌日、顕微鏡で細胞を確認します。続行する前に、細胞は70〜80%コンフルエントである必要があります。
2. 100 mmディッシュあたり7 μgのプラスミドDNAと21 μlのトランスフェクション試薬の合計混合物で細胞をトランスフェクションします。トランスフェクション効率のコントロールとしてGFPを発現するベクター(表1)を持つ細胞をトランスフェクションします.
   手記：ドキシサイクリンに応答して2つ以上の複雑なサブユニットの発現を誘導するHEK293-T-RExまたは類似の安定細胞株を使用する場合、誘導体を細胞に添加し、48時間インキュベートする必要があります。同様に、誘導物質の添加によりGFPの発現を誘導する安定な細胞株も、バリデーション目的で必要となります。手順 2.7 に進みます。
3. 100 mmディッシュごとにトランスフェクション混合物を準備します。1.5 mLの微量遠心チューブに、未添加のDMEM500 μlと7 μgの全プラスミドDNA(2つ以上のプラスミドに相当)を混合します。別の微量遠心チューブで、500 μlの未添加DMEMと21 μlのトランスフェクション試薬を混合します。トランスフェクション反応ごとに繰り返します。
4. トランスフェクション試薬溶液をプラスミドDNA溶液にピペットで移します(溶液を逆の順序で混合しないでください)。ピペッティングで少なくとも4回
混合します。
5. この混合物を室温で10〜15分間、15分以内にインキュベー
トします。
6. プレートを傾けて培地リザーバーを作成し、細胞を乱さずにトランスフェクション混合物をプレートの内側に慎重にピペットで滴下します。皿を元の平らな位置に戻し、穏やかに渦を巻いて混合物を分散させます。
7. 加湿細胞培養インキュベーターで細胞を37°Cでインキュベートし、5% CO₂(この条件を以下「組織培養インキュベーター」と呼びます)します。トランスフェクションの5時間後に培地を交換します(オプション)。

3. トランスフェクションまたは誘導効率の確認

1. トランスフェクション後24時間後に、蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、トランスフェクション効率(またはGFPを発現するコントロールHEK293T-REx安定細胞株の誘導)を確認します。さらに24時間インキュベートします。

4. STREP Affinity Purification (STREP AP)

1. 細胞の収集
   1. トランスフェクション後48時間で、培地を取り出し、8 mLの冷たい1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えます。ピペットを上下に動かして、細胞をプレートから取り外します。
   2. 細胞懸濁液を回収して15 mLチューブに移し、細胞を800 x gで4分間、4°Cでスピンダウンします。
   3. PBS上清を取り除きます。スピンダウン(800 x g、4°Cで1分間)を繰り返して、残留PBSを除去します。細胞ペレットを-80°Cで保存して後で使用するか、以下の手順に従ってタンパク質精製を続行してください。
2. 細胞の溶解
   1. Passive Lysis Buffer (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, protease inhibitor cocktail tablet, 5% v/v glycerol, and 1.0% NP-40) の細胞ペレット容量の 5× (1 プレートあたり ~250 μl) を使用して細胞ペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を 1.5 mL の微量遠心チューブに移します。
   2. 懸濁液を短時間ボルテックスし、4°Cで30分間定型動します。
   3. 細胞懸濁液を10,000 x gで4°Cで10分間スピンダウンします。
   4. 可溶性ライセートを新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、細胞ペレットを廃棄します。可溶性ライセートの最終容量の10%を「STREP AP Input」として保存し、4°Cで保存します。
3. STREPビーズの平衡化
   手記：最初のAPステップにはSTREPビーズを使用してください!STREPビーズで引き下げた複合体は、FLAGビーズで引き下げた複合体よりも有意に多くのタンパク質を回収します。
   1. 50% STREPビーズスラリー(n = サンプル数)を取り出し(n × 40 μl) + n μl取り出し、1,500 x gで4°Cで2分間スピンダウンします
      注意: ビーズをピペットで動かすには、広口の先端を使用してください。
   2. 上清を取り除き、ビーズに500μlのPLBを加えます。ビーズ混合物を4°Cで5分間定型し、1,500 x gで4°Cで2分間スピンダウンします。
      1. 合計3回の洗浄を繰り返します。PLB中のビーズを最終容量n × 40 μlまで再懸濁します。
   3. 50% STREPビーズスラリー40 μLを各細胞ライセートサンプルに添加し、4°Cで2時間ヌテートします。
4. 連鎖球菌AP
   1. 溶液を1,500 x gで4°Cで2分間スピンダウンします。
   2. 上清を取り除き、「STREP AP Flow-through(FT)」として4°Cで保存します。
   3. 500 μl の STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7.5、250 mM NaCl、1.5 mM MgCl₂、1 mM DTT、5% グリセロール、0.2% NP-40) をビーズに加えます。ビーズ混合物を4°Cで5分間ニューテートし、1,500 x gで4°Cで2分間遠心分離します。
      1. 合計4回の洗浄を繰り返します.
         手記： 4回目の洗浄の前に、ビーズ溶液を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、タンパク質のバックグラウンドを減らします。この手順は不可欠です。
   4. 500 μl Wash Buffer II (100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA) を加え、チューブを反転させてビーズを平衡化します。1,500 x gで4°Cで2分間スピンダウンし、上清を捨てます。
   5. 50 μLのSTREP Elution Buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA、および2.5 mM Desthiobiotin) で目的のタンパク質を溶出します。800rpmで4°Cで15分間渦
   巻く。
   6. ビーズを1,500 x gで4°Cで1分間スピンダウンし、上清を回収します。この画分は、「STREP AP溶出」サンプルに対応します。
   7. ビーズ画分を4°Cで保存して2回目の溶出を行うと、最初の溶出で得られるタンパク質の量の最大半分が得られる可能性があります。STREP AP溶出液の10%をアリコートして、銀染色および/またはウェスタンブロッティングに
   用いてください。
5. FLAGビーズの平衡化
   1. FLAGビーズ溶液(n = サンプル数)を取り出し、1,500 x gで4°Cで2分間スピンダウンします
      手記：口の広い先端を使用してビーズをピペットで動かします。
   2. 上清を取り除き、500 μLのFLAG洗浄バッファー(100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA、および0.1% NP-40)をビーズに加えます。1,500 x gで2分間、4°Cでスピンダウンし、合計3回の洗浄を繰り返します。
   3. ビーズをFLAG洗浄バッファーに再懸濁し、最終容量n x 16 μlにします。
   4. 残りのSTREP AP溶出液に16 μlのFLAGビーズスラリーを加え、4°Cで一晩中ニューテートします。

5. IP フラグ

1. FLAGビーズ懸濁液を1,500 x gで2分間、4°Cでスピンダウンし、上清を保存し、4°Cで「FLAG IP Flow-through」(FT)として保存します。
2. 500 μlのFLAG洗浄バッファーを溶液に加えます。4°Cで5分間ニューテートし、1,500 x gで4°Cで2分間遠心分離します。合計4回の洗浄を繰り返し、各洗浄後に上清を除去します
   手記：4回目の洗浄の前に、タンパク質ビーズ溶液を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移して、バックグラウンドを減らします。この手順は不可欠です。
3. 最終スピンから上清を取り除き、200 ng/μlのFLAGペプチドを含む30 μLのFLAG洗浄バッファーをビーズに加えます。800rpmで4°Cで2時間渦
巻きます。
4. 懸濁液を 1,500 x g で 2 分間、4 °C でスピンダウンし、上清を採取し、4 °C で「FLAG IP Elution」として保存します。
   手記：溶出サンプルは、標準プロトコルを使用してシルバーステインおよび/またはウェスタンブロットで確認でき、さらなるタンパク質アッセイの準備ができています。ウェスタンブロットを設定する際には、(1)STREP APインプット、(2)STREP AP FT、(3)STREP AP溶出、(4)FLAG IP FTおよび(5)FLAG IP溶出のサンプルをすべて実行してください。ロードされるボリュームは、実験ごとに決定する必要があります。収集したすべてのサンプルとビーズは、短期保存の場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで保存できます。TAPサンプルは、質量分析法で分析して、その成分の同一性を確認したり、新規の翻訳後修飾(PTM)を同定したり、精製された複合体との新しいタンパク質相互作用を発見したりすることができます。この目的のために、クマシーゲルまたはシルバーステインを走らせた後、きれいなメスを使用してゲルからバンドを切除することができます。質量分析法について論じた優れたレビューがこれまでにいくつか発表されています。

結果

表1:この研究で使用したプラスミド CycT1およびCDK9をpcDNA/4TO-STREPおよびpcDNA/4TO-FLAGプラスミドベクターにライゲーションした。これらのコンストラクトをDH5αコンピテントセルに形質転換し、LB-アンピシリンプレートに播種しました。コロニーを選抜し、成長させ、スクリーニングしました。ライゲーションに成功したクローンは、サンガーシーケンシングと制限酵素処理とアガロースゲル電気泳動の組み合わせによって検証されました。CycT1については、最後の18残基にタンパク質分解のシグナルペプチドとして機能するPEST配列(プロリン、グルタミン酸、セリン、およびスレオニンが豊富なペプチド配列)が含まれているため、完全長(1 - 726)ではなく短いバージョン(1 - 708)を使用しました。CDK9はフルレングスでした。タンデムSTREPタグのシーケンスは、GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSGSHPQFEKです。タンデム FLAG タグの順序は、GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	フィッシャーサイエンティフィック	SH30022FS
ウシ胎児血清	ハイクロン	SH30071
ペニシリン/ストレプトマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	MP091670049
ポリジェット	フィッシャーサイエンティフィック	50-478-8
プロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11836153001
STREP-タクチンスーパーフロー	IBの	2-1208-010
STREPタグ溶出バッファー	IBの	2-1000-025
EZview レッド アンチフラッグ M2 アフィニティジェル	シグマ	SLBQ1981V
コーニング 100mm × 20mmスタイル ディッシュ細胞培養処理 非発熱性ポリスチレン 20/スリーブ	コーニング	430167
プロテインLo-Bind エッペンドルフ	フィッシャーサイエンティフィック	13-698-794
デジタルボルテックスミキサー	フィッシャーサイエンティフィック	02-215-370
48穴マイクロチューブフォームラック	フィッシャーサイエンティフィック	02-215-386
Labquakeシェイカーロティサリー	熱	415110

(代表) (代表)