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本研究では、CVN-Nの代わりにCVN-small ubiquitin-like modifier (SUMO) fusion proteinが酵素結合免疫吸着アッセイに使用されており、細胞ベースのアッセイに適しています。組換え完全長インフルエンザA型インフルエンザウイルスHA H3タンパク質は、市販(材料表参照)で得られるか、または標準的なプロトコルに従って哺乳類のHEK293細胞株およびバキュロウイルス感染昆虫細胞で発現されます。武漢-1スパイクタンパク質は、哺乳類のHEK293細胞で発現しています。モンマンノシル化ペプチド(MM)およびジマンノシル化ペプチド(DM)の合成により、CVN2およびモノマンノシル化低分子への均質なリガンドの検出が可能になります。
1. CV-N コンストラクトの作成
- CVN2バリアントとCVN2L0タンパク質(PDB ID 3S3Y)のそれぞれについて、市販のソースから、N末端pelBリーダー配列とpET27b(+)ベクターのHisタグを含む遺伝子コンストラクトを取得します(表1を参照)。
- CVN2L0 とそのバリアント (V2、V3、V4、V5;図1A、C)を背景に、各CV-Nリピートの2つの異なるDNA配列からなるCVN2L0テンプレート遺伝子
。
- 凍結乾燥プラスミドDNAを滅菌脱イオン蒸留水(ddH2O)に溶解し、最終濃度100 ng/μLにします。
2. プラスミドDNA形質転換細胞を用いたLB寒天プレートの作製
- 10 g/Lのペプトン、5 g/Lの酵母抽出物、および5 g/LのNaClをddH2O(材料表を参照)に溶解して培地LB-Lennoxを調製し、pHを7.4に調整します。以前に発表されたレポートに従って、化学的方法により、各バリアント(V2-V5)について、有能な大腸菌BL21(DE3)への変換を行います。
- 溶液(900 μLと100 μL)を分け、100 μLをLB寒天プレート(50 μg/mLカナマイシン)に移し、滅菌セルスプレッダーを静かに使用します。寒天プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
3. クローニング
- CV-Nの遺伝子をpET11aのNdeIおよびBamHI部位にサブクローニングします(材料表を参照)参照後、エレクトロコンピテント細胞への形質転換(エレクトロポレーション)を行います。
4. 部位特異的突然変異導入
- 各CV-Nリピートに対して2つの異なるDNA配列を含むCVN2L0テンプレート遺伝子のバックグラウンドでCVN2L0および変異型CVN-E41Aを生成すること。
- 部位特異的突然変異誘発キット(材料表参照)と特異的変異原性プライマー5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3'および5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacgttctctc-3'を使用して変異を行います。
- 5〜50 ngの範囲の複数の濃度の二本鎖DNA(dsDNA)テンプレート(例:5、10、20、および50 ngのdsDNAテンプレート)を使用して、一連のサンプル反応を開始します。プライマー濃度を一定に保ちます.
手記：PCRミックスおよびサーマルサイクリングプロトコールは、一般に、部位特異的変異誘発キットの取扱説明書に記載されているとおりに使用されます。
- DpnI制限酵素(1 μL、10 U/μL、材料表参照)を鉱物油オーバーレイの下に加えます。反応を完全かつ穏やかに混合し、卓上微量遠心分離機で1分間スピンダウンし、すぐに37°Cで1時間インキュベートして親のスーパーコイルdsDNAを消化します。
5. 細菌細胞の形質転換
- XL1-Blueスーパーコンピテントセル(材料表を参照)を氷上で静かに解凍します。各コントロールおよびサンプル反応を形質転換するには、スーパーコンピテントセル(50 μL)を予め冷却したポリプロピレン丸底チューブ(14 mL)に分注します。
- 各コントロールおよびサンプル反応(変異ssDNA)からDpn I処理一本鎖DNA(ssDNA)1 μLをスーパーコンピテントセルの分離アリコートに移し、相補鎖を合成します。形質転換反応を慎重に渦巻かせ、氷上で反応を混合してインキュベートします
手記：Dpn I処理DNAを形質転換反応に移す前に、ピペットチップから残っている鉱油を慎重に除去することをお勧めします。オプションのコントロールとして、0.1 ng/μL の pUC18 コントロールプラスミド (1 μL) と 50 μL のスーパーコンピテントセルを混合して、XL1-Blue スーパーコンピテントセルの形質転換効率を確認する必要があります。
- 42°Cで45秒間の形質転換反応に熱パルスを印加し、次いで反応を氷上に2分間置く
手記：加えられた熱パルスは、ポリプロピレン丸底チューブ(14mL)で前述の条件に対してすでに最適化されています。
- 0.5 mLのNZY+ブロス(1リットルあたり含有:10 gのNZアミン(カゼイン加水分解物)、5 gの酵母抽出物、5 gのNaCl、12.5 mLの1 M MgCl2、12.5 mLの1 M MgSO4、10 mLの2 Mグルコース、pH 7.5、42°Cに予熱)を加え、225-250 rpmで1時間振とうしながら37°Cで形質転換反応をインキュベートします。LB-アンピシリン寒天プレート上の各形質転換反応(コントロールプラスミド形質転換から5 μL、サンプル形質転換から250 μL)
手記：形質転換制御および突然変異誘発のために、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal、80 μg/mL)およびイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG、20 mM)を有するLB-アンピシリン寒天プレート上に細胞を広げます(材料の表を参照)。形質転換大腸菌細胞の単一コロニーを細胞培養物50mLに接種し、変異したプラスミドDNAを精製して分析します。突然変異誘発は、外部施設でのDNAシーケンシングにより確認されます。
6. 発現とタンパク質精製
- 大規模培養の場合は、形質転換プレートから少量のLB(アンピシリンを含む)に単一のコロニーを接種します。
- 一晩培養して、発現培養物に10 mMのMgCl2、10 mMのMgSO4、20 mMのグルコースなどの添加物を接種し、種子培養物を1/100に希釈します。
- 37°Cで激しく振とうしながら細胞を増殖させ、細胞をAbs 600 nmで0.4-0.6(中対数期)まで増殖させた後、細胞を20°Cに冷却します。1 mM IPTGで誘導し、一晩増殖させます。
- その後、4,000 x gで4°Cで15分間遠心分離して細胞を回収し、上清をピペットで捨てます。
- 細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液に再懸濁し、4,000 x gで4°Cで15分間再遠心分離します。次に、上清をピペットで捨てます。残りのペレットを10 mLの溶解緩衝液に再懸濁し、懸濁液を37°Cで1時間インキュベートします
手記：溶解緩衝液の組成:(50 mMのNaH2PO4、300 mMのNaCl、2% Triton-X 100、500 ng / mLのリゾチーム、1 mMのフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、1 mMのジチオスレイトール、1 mMのMgCl2、pH 8、材料の表を参照)。
- 混合物を2回の凍結融解サイクル(-80°C)にかけます。4,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離することにより、可溶性画分と不溶性画分を分離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE)、特にドデシル硫酸ナトリウム (SDS)-PAGE (図 1B, C).
を使用して分析します。
手記：細胞は、凍結融解、超音波処理、均質化、酵素溶解、またはこれらの方法の組み合わせなど、いくつかの方法で溶解できます。インクルージョン体からの精製は、高タンパク質収量の収集に推奨されます。
- Ni-NTA カラムクロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製します(材料の表を参照)。可溶性画分を再生したNi-NTAビーズカラム(1 mL/分)にロードします。TBSバッファー(50 mMのTris、150 mMの塩化ナトリウム、pH 7.5)でシステムを洗浄してから、グラジエント(TBS中の0-100% 500 mMイミダゾールを60分間以上)を開始し、フラクションを回収します(1 mL/分)。精製したタンパク質を透析して、100 mM PBSに対する生化学的特性評価を行います(図1C、D)。
- あるいは、14 mLチューブにHis-Select Ni2+アフィニティーゲル(材料表を参照)を使用して、Hisタグ付き組換え発現CV-Nを緩衝液中にそれぞれ20 mMイミダゾールおよび250 mMイミダゾールと結合し、再懸濁します。バッチで少なくとも30分間インキュベートします.
手記：これらの半精製タンパク質をシングルユースのプレパックカラムに適用して、生体サンプル(炭水化物やタンパク質など)のバッファー交換とクリーンアップを行い、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーから1〜1.5 mLの溶出液をロードできます。
- タンパク質溶液を10 kDaカットオフフィルター(材料表を参照)で遠心分離チューブに移し、4,500 x g、4°Cで10分間遠心分離して濃縮します。SPR測定では、分析種溶液を10 mM HEPES、150 mM塩化ナトリウム、3 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および0.05% Tween20、pH 7.4(HBS-EP(+))に交換します。
- このSPRランニングバッファーを希釈係数1:10で加え、4,500 x g、4°Cで10分間、初期容量に4回遠心分離します。
- NanoDrop UV-Vis分光光度計(材料表を参照)を使用して、23,474 Daのサイズを示す主タンパク質CVN2L0の計算された吸光係数(20,440 M-1 cm-1)に基づいて、280 nmでのタンパク質濃度を決定します。PBS(100 mM、pH 7.0)またはSPRバッファーをブランクとして使用し、3つの希釈ステップ(1:1、1 1:10、1:100)。
7. SPR分光法
- デュアルチャネルSPRシステム(材料表を参照)と、ランニングバッファーHBS-EP(+)および再生バッファーとして10 mMグリシンHCl pH 1.5-1.6を使用します。装置、デガッサー、オートサンプラー、ポンプの電源を入れ、ddH20でシステム全体を1時間洗浄します。すぐに使用できるランニングバッファーを別のボトルに入れます。
- 検出器に液浸油を滴下し、薄い金膜でコーティングされ、上面にカルボキシメチルデキストランヒドロゲルで官能基化されたガラスセンサーチップ(材料表を参照)を3ポートフローセルの下の検出器に直接取り付けます。ハンドリングを引き下げて設定を修正します.
手記：C19RBDHC30M 200 nm ストレプトアビジン誘導体カルボキシメチルデキストランヒドロゲルと中密度のビオチン化重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2 RBD タンパク質は、固定化リガンドがあらかじめ組み込まれたすぐに使用できるセンサーチップです。
8. CV-NのHA、Sタンパク質、RBDへの結合のためのSPR結合アッセイ
- 以下の手順に従って、タンパク質性リガンドをセンサーチップに固定化します。
- メニューバーの「フォーム」をクリックし、統合されたSPRAutoLinkソフトウェアの「Run Table Editor」をクリックして、ランテーブルを開きます(「マテリアルの表」を参照)。利用可能なランテーブルのリストからBASIC_Immobilizationを選択してクリックし、コンピュータ画面上の実験手順の手順に従います。使用されているそれぞれのサンプルエディターは、右上隅に表示されます。
- 「Form」セクションの「Sample Set Editor」をクリックして、オートサンプラーに配置された2つのラックの試薬リストに入力し、さらに分析します。メニューバーの「ツール」としてAutosampler Direct Controlをクリックして、ラックを前面またはホームに戻します。動作温度として4°Cを選択します。
手記：SPRソフトウェアでは、対応するツールを選択したり、オートサンプラーの取り扱いを行ったり、フォームをクリックしたりすることで、「SPR Instrument Direct Control」と「Pump Direct Control」を行うことができます。また、Run Table Editor、Data-Plot、またはPost-Processingを選択してデータ分析を実行することもできます。ファイルはデフォルトのディレクトリに直接保存され、ポストプロセッシングウィンドウからscrubber.filesとしてエクスポートされます。
- [ツールとポンプダイレクトコントロール]をクリックしてddH20を注入するポンプを開始し、SPR Instrument Direct Controlをクリックしてデータを記録し、毎回新しく表示されたウィンドウで開始します。カップリング試薬(ステップ8.3)を300 μLバイアルに入れ、オートサンプラーラックに入れ、Run.
をクリックしてランテーブルを開始します。
手記：チップ表面は、10 mM グリシン緩衝液 pH 9.0 でコンディショニングするか、1 M 塩化ナトリウム、0.1 M ホウ酸ナトリウム緩衝液 pH 9.0 でフラッシュして、EDC/NHS 活性化ミックスのカルボキシル誘導体化チップ表面をコンディショニングします。
- この単純なタンパク質間相互作用のために、CMD500Dチップ(材料表を参照)を使用して、固定化されたHAを有する微小屈折率単位(μRIU)= 2500 - 3000フローセルおよびスパイクタンパク質を有するμRIU = 400フローセルを生成する。注入流速 15 μL/min で、0.4 M N-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩 (EDC*HCl) と 0.1 M N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) の水溶液と等価混合物を注入します。
- ポンプを25,000 μL/minで補充し、ベースライン調整を30秒間行い、90 μLのサンプル活性化溶液(EDC/NHS)を6分間の接触時間で注入し、さらに5分間保持します。
- ベースラインを10 μL/minで1分間、左のフローセル(青)のみに繰り返して、化学合成したペプチド、HA、およびスパイクタンパク質を20 μg/mLで注入して固定化し、その後のベースライン調整をddH2Oで1.5分間行い、その後のベースライン調整を行った後、活性化チップ表面を1 MエタノールアミンHCl pH 8.5でクエンチします。
- 液体サンプラーのチューブをddH20のデガッサーにHBS-EP(+)でボトルに切り替えます(図2)。
- SPRセンサーグラムを分析します。
- 速度論的研究を行うには、さまざまな分析種濃度(10-5-10-8 M)を使用し、各注入後に再生ステップを行い、さまざまな分析種の後にブランク測定を行います。流速を 10 μL/min に変更し、4 分間の接触時間で注入を開始し、次に 5 分間のベースライン生成を行い、それぞれ 2 分間の 2 つの再生ステップを 30 秒間隔で
開始します。
- ブランク測定用のバッファー溶液を注入し、そのセンサーグラムをサンプルランから差し引いて、さまざまなタンパク質濃度を正規化します。
- フォームをクリックし、下にスクロールして、この操作モードをクリックして「後処理」に変更します。「追加」をクリックして、各フローセルのデータプロットフォームで経時的に生成されたバインディング曲線を選択し、オーバーレイをスクラバーファイル(.ovr)としてエクスポートします。[ファイル]をクリックして、ファイル保存オプションを開きます。応答曲線は、左右の曲線を整列させ、リガンドチャネルの信号から2番目の参照チャネルの信号を差し引くことによって得られます。
手記：データは、センサーグラムを計算的に定義することにより、「ポストプロセッシング」で操作されます。これは、左右のフローセルからのセンサーグラムのオーバーレイに入れられるか、または両方のチャネルの差からセンサーグラムとして表されます。
- 結合測定の前後に、pH 9.5 の 50-100 mM グリシン緩衝液、水、および 20% エタノールで流路系全体を洗浄し、微量の塩分やタンパク質汚染を除去するか、0.5% SDS とグリシン (0.5% SDS)で
手記：機器の損傷を防ぐために、チップがバッファーの下または100%の湿度で保管されている場合は、チップカートリッジを機器に再挿入する前にガラスチップの機械的安定性を確認することをお勧めします。
表1:CVN2L0およびCys-Cys結合バリアントV2、V4、およびV5のHAへの結合について、SPRセンサーグラムから得られた動態データ。KD[M] = kオフ/ kオンまたはkd /ka。すべてのデータは、HBS-EP(+)バッファで25°Cで生成されます。
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| 分析対象物 | [M-1*s-1]のk | Kオフ [S-1] | KD |
| CVN2L0 | 5.1 E3 | 1.3 E-3 | 255 nM |
| V2 | 4.0 E3 | 1.1 E-3 | 275 nM |
| V4 | 1.2 E3 | 1.3 E-3 | 11 μM |
| V5 | 1.2 E3 | 5.8 E-2 | 5 μM |
