原子レベルのタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴

要約

出典:Winkelaar, G., et al.核磁気共鳴分光法(NMR)およびマイクロスケール熱泳動(MST)による球状および糸状タンパク質の相互作用の測定。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、¹⁵のN標識野生型および変異型エンボプラキンタンパク質と非標識ビメンチンタンパク質との間のタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴分光法の技術について説明しています。野生型エンボプラキンとビメンチンとの相互作用が成功すると、NMRスペクトルでは広範な線幅が広がり、ピークが消失しますが、変異したエンボプラキンとビメンチンとの間に相互作用がないと、NMRスペクトルではピークが十分に分解されます。

プロトコル

1. NMRの方法

1. NMRサンプル調製
   1. 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7を使用して^、15N標識野生型またはR1914E E-PRDタンパク質を精製します。タンパク質ストック溶液は通常、0.3〜1 mMの範囲で、容量は約1 mLです
      手記：タンパク質は、MWCO 3 kDa、5 mL遠心式限外ろ過装置を使用して>100 μMまで濃縮し、サンプル調製に適した範囲に濃縮することができます。
   2. 非標識VimRodタンパク質のサンプルを、20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7を使用して精製します。
   3. 最終容量500 μLで、野生型または変異型E-PRDタンパク質を最終濃度100 μMに、酸化重水素(D₂O)を最終濃度10%(v / v)に、DSS(4,4-ジメチル-4-シラペンタン-1-スルホン酸)を最終濃度20 μMに添加します。20 mM Tris-HClを使用してサンプル容量を最大500 μLにします。 1 mM DTT、および pH 7。代表的なサンプル調製を表1.
      に示します。 手記： DSSの0ppm共鳴は、¹H化学シフトの較正や、タンパク質の¹⁵N化学シフトの間接参照に使用されます。D₂Oは、分光器を一定の正味磁場で動作させるための重水素ロック信号に使用されます。
   4. 前のステップと同様に、E-PRD、D₂O、および DSS の 2 番目のサンプルを作成し、VimRod を最終濃度 50 μM まで追加してから、容量を 500 μL まで上げます。
   5. 500 μLのサンプルを5 mm幅のNMRチューブに移して実験します。

2. NMR実験装置

1. イジェクトコマンド「ej」でエアフローをオンにします。これにより、サンプルが磁石から浮き上がります。次に、サンプルを磁石の上の開口部の上にあるスピナー内に置き、コマンド「ij」で挿入します。サンプルが磁石内に落ち着くまで待ってから、先に進みます。
2. 「edc」コマンドを使用して新しいデータセットを作成し、実験「ZGPR」を選択して標準の^1HNMRパラメータをロードします(図1)。NAME、EXPN(実験番号)、PROCNO(処理済みデータフォルダ番号)のフィールドに入力します。「Set solvent」フィールドで溶媒を選択し、「Execute 'getprosol'」をクリックして、標準プローブヘッドと溶媒依存性(prosol)パラメータを読み取ります。
3. 「lock」コマンドを使用して、サンプルを重水素化溶媒、すなわちD₂Oにロックし、掃引が終了してロックされるまで待ちます。
4. 自動チューニングコマンド「atma」を使用してサンプルをチューニングすることにより、磁石の共振周波数を補正します。自動チューニングが完了するまで、ウォブルカーブを監視します。
5. TOPSHIMを使用して磁場をシムします(コマンド「topshim」)。シミングとは、サンプルの周囲に均一性を持たせるために磁場を調整するプロセスです。コマンド "wsh" を使用して shim 値を格納し、同じまたは類似のサンプルを使用する場合は、topshim の前に "rsh" を使用して読み取ることをお勧めします。
6. 「rga」コマンドでレシーバーゲインを調整して、最大の信号対雑音比を達成します。
7. スペクトルの中心を水共鳴オフセット(o1)に置き、「calibo1p1」を使用して90度のプロトンパルス(p1)を高出力に設定します。
8. ゼロゴー「zg」コマンドを使用してプロトンスペクトルを収集し、指数関数的乗算(「em」)を含む「efp」、線の広がりを組み込んだ自由誘導崩壊(FID)、FIDの「ft」フーリエ変換、および位相補正を適用する「pk」を含むプロセスを使用します。
9. 自動位相補正 "apk" と自動ベースライン補正 "absn" を積分なし多項式オプションを使用して適用します。
10. SOFAST HMQC 実験の新しいデータセット (1.2.2 など) を作成するには、実験で [SFHMQC3GPPH] を選択します。
11. 最適化された P1 と O1 を陽子スペクトルからコピーし、コマンド "getprosol 1H p1 plw1" (p1 は最適化された P1 値、plw1 は P1 の電力レベル) を使用して P1 依存パルスをインプットします。
12. CNST54定数を最適化してアミド化学シフトのオフセットを設定し、CNST55を最適化して帯域幅を定義して、関心のあるスペクトル領域を包含してレシーバーのゲインを最適化できるようにします(図2)。これらのパラメータを選択するには、2次元スペクトルから最初のFID(自由誘導減衰)を抽出し、観測された信号を探してそれらを定義します。さらに、緩和遅延(D1)、スキャン数(NS)、ダミースキャン(DS)を変化させて、コマンド「gs」を使用して許容可能な信号感度を得ることができます。これにより、goとscanはリアルタイムでデータ品質を監視できます。
13. Zero Go "zg" を使用してスペクトルを記録します。

>表 1.NMRサンプル調製。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名

見本	バッファーAに1 mM E-PRDを充填(μL)	バッファー A1 (μL) 中の 1mM VimRod	バッファーA (μL)	200 μM DSS in D2O (μL)	バッファー B2 (μL)	総容量(μL)
E-PRD単体	50	0	50	50	350	500
E-PRD+ビムロッド	50	50	0	50	350	500
1バッファー A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
>2バッファー B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

結果

図1:NMR実験のセットアップの画面キャプチャ。表示されているウィンドウは、HSQCデータセットを収集するための標準的な実験を設定するために使用されます。実験パラメータは、実験の隣に読み取られます。示されているZGPR実験は、標準および溶媒依存のプロトンパラメータをロードするための初期実験として選択されています。タイトルウィンドウは、記録保持の目的で実験の詳細を入力するために使用されます。HSQCスペクトルを収集するために、ZGPR実験はSFHMQC3GPPHに置き換えられます。

図2:NMR実験パラメータの調整。<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化アンモニウム(15N、99%)	ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ	NLM-467	NMRのための同位体標識
D2O、酸化重水素(D、99.8%)	ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ	DLM-2259	NMRサンプル調製
DSS、ナトリウム2,2-ジメチル-2-シラペンタン-5-スルホン酸-D6(D,98%)	ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ	DLM-8206	NMRのリファレンス
精密5 mm NMRチューブ、長さ7インチ	SJM /重水素チューブ	ボロエコ-5-7	NMRチューブ
NMR分光計(14.1テスラ)	ブルカー		NMRデータの取得
TCI 5mm z-PFG極低温プローブ	ブルカー		NMRデータの取得
ソフトウェア
ブルカーTopSpin 4.0.1	ブルカー		NMRデータの処理