ファージディスプレイを用いて標的タンパク質に高い親和性を持つタンパク質を選択

要約

出典: Zhang, W., et al., Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、標的タンパク質に対して高い親和性でタンパク質を発現する遺伝子組み換え済みファージを単離するファージディスプレイ技術を実演します。

プロトコル

1. ファージライブラリを準備します

1. ファージライブラリーを氷上で解凍し、PBSのライブラリー多様性の100倍に希釈します。例えば、ライブラリーの多様性が 1 x 10¹⁰ で、ライブラリーの濃度が 1 x 10¹³ の場合、濃度が 1 x 10¹² になるようにライブラリーを希釈します。ここで使用するライブラリーは、ライブラリー1mLとPBS9mLを組み合わせてPBSで10倍に希釈します
   手記： 図書館の多様性は図書館の作成時に決定されるべきであり、それ以外の方法では簡単に評価することはできません。ライブラリ濃度は、中対数期(OD600 0.6 - 0.8)の大腸菌細胞を接種し、LB/carbにめっきすることで決定できます。
2. PEG/NaClの1/5ボリュームを追加します。例えば、以前に希釈したライブラリー 10 mL に対して、2 mL の PEG/NaCl を添加します。
3. 氷上で30分間インキュベートします。
4. 11,000 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離し、上清を捨て、再遠心分離して 2 分間再遠心して残りの上清を引き下げます
   手記：2回目は、ペレットを同じ場所に保持するために最初にチューブをローターと同じ向きでローターに入れると、見やすくなります。
5. ファージペレットをタンパク質あたり1 mLのPBTに穏やかに再懸濁します。タンパク質が4つの場合は、ペレットを4 mLのPBTに再懸濁します
   手記：ペレットに触れたり、気泡を入れたりしないようにしてください。

2. 標的タンパク質にファージを表示します。

1. オプションのコントロール:コントロールプレートの各コーティングウェルに100μLのファージライブラリーを添加します。室温(~20-25°C)で1時間インキュベートし、300 rpmのオービタル振盀を行い、ライブラリーをコントロールプレートからターゲットプレートに移します。
2. ターゲットプレートからPBバッファーを取り出し、コーティングされた各ウェルに100 μLのファージライブラリーを加えます。
3. 室温(~20-25°C)で1時間インキュベートし、300rpmのオービタル振盪を行います。

3. 1つのファージを丸く溶出

させる

1. ファージライブラリーを取り出し、コーティングされたウェルをPTバッファーで4回洗浄します。プレートを裏返し、ペーパータオルで軽くたたいて最後の一滴を取り除きます。
   手記：1枚のプレートに複数の標的タンパク質がコーティングされている場合は、ウェル間の後続のすべての溶液の流れを最小限に抑えるようにしてください。
2. 0.1 M HClを100 μLを各コーティングウェルに添加し、室温で5分間インキュベートし、300 rpmのオービタル振盪を行います。
3. コーティングされた各ウェルに12.5 μLの1 M Tris-HCl(pH 11)を添加して、pHを中和します。
4. 8つのウェルすべてから溶出したファージを1本の1.5 mL微量遠心チューブにプールします。移し替え中にピペットを上下に動かして、溶液を均一にし、ウェルからすべての液体を吸引します。
5. プールされた溶出ファージに10%BSAを添加し、最終濃度を1%にします。一般的なラウンド1回の溶出量が950 μLの場合、10% BSAを95 μL追加します。4°Cで保存してください。これがラウンド 1 の出力です。

4. 次の選考ラウンドの準備

1. ステップ1.1のように、次の選択ラウンドのためにファージインプットを培養するための種子培養物を準備します。
2. ステップ1.2と同様に、3回目の選択ラウンドのプレートに、以下に示す変更を加えてコーティングします。
   1. タンパク質ごとに4つのウェルのみを96ウェル結合プレートにコーティングします。「ラウンド2/3」または「ラウンド4/5」チューブの内容物の半分を適切なラウンドに使用します。これらのチューブの内容物は、タンパク質が溶液から沈降しないように、必要に応じて希釈します。
3. 次の選択ラウンドのためにファージインプットを準備します。
   1. ラウンドワン出力の半分を使用して、3 mLの中対数期細胞を接種します。一般的なラウンド1出力の場合、出力の500μLを接種します。
   2. 37°Cで30分間インキュベートし、200 rpmのオービタル振とうを行います。
   3. M13K07ヘルパーファージを最終濃度1 x 10¹⁰ PFU/mLまで添加します。
   4. 37°Cで1時間インキュベートし、200 rpmのオービタル振とうを行います。
   5. 3 mLの培養物全体を30 mLの2YT/carb/kanに移します。200rpmの軌道振とうで37°Cで一晩成長します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Axygen Mini チューブシステム (0.65 mL、滅菌済み、96/ラック、10ラック/パック)	フィッシャーサイエンティフィック	14-222-198	プラスチック製品
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	フィッシャーサイエンティフィック	DF0446-17-3	力価測定用のプレートの準備
ウシ血清アルブミン(BSA)、フラクションV	バイオショップカナダ	ALB001	バッファコンポーネント
カルベニシリン二ナトリウム塩89.0-100.5%無水物	ミリポアシグマ	C1389-5G	ファージミド感染細胞の培養
コンパクトデジタルマイクロプレートシェーカー	フィッシャーサイエンティフィック	11-676-337	デバイス
コーニングマイクロプレートアルミニウムシーリングテープ	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-684	ファージグリセロールストックのシーリング
乾燥寒天	フィッシャーサイエンティフィック	DF0140-01-0	力価測定用のプレートの準備
DS-11分光光度計/蛍光光度計	デノビックス	DS-11 FX+(デジタルエスエフプラス)	デバイス
Greiner Bio-One CellStar 96ウェル、未処理、U字型底マイクロプレート	フィッシャーサイエンティフィック	7000133	プラスチック製品
塩酸	フィッシャーサイエンティフィック	A144-500	ケミカル
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R ケミカルコンピテント大腸菌	フィッシャーサイエンティフィック	C854003	ファージ感染に対する細菌株
カナマイシン硫酸塩	フィッシャーサイエンティフィック	AAJ1792406	M13K07ヘルパーファージ感染細胞の培養
M13KO7ヘルパーファージ	ニューイングランドバイオラボ	N0315Sの	ファゲミドのパッキングと分泌を許可する
MaxQ 4000 ベンチトップオービタルシェーカー	フィッシャーサイエンティフィック	11-676-076	デバイス
Nunc MaxiSorp 96 ウェルマイクロプレート、平底	ライフテクノロジー	〒44-2404-21	プラスチック製品
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)10X溶液	フィッシャーサイエンティフィック	BP3994	バッファーコンポーネント/ファージ再懸濁培地
ELISAおよびインキュベーション用のポリエステルフィルム	VWRの	60941-120	インキュベーション中のマイクロプレートの被覆
ポリエチレングリコール8000(PEG)	フィッシャーサイエンティフィック	BP233-1	ファージの沈殿
塩化ナトリウム	ミリポアシグマ	S3014	ファージの沈殿
滅菌プラスチック培養チューブ:半透明ポリプロピレン	フィッシャーサイエンティフィック	14-956-1D	ファージインプットの培養
テトラサイクリン塩酸塩	フィッシャーサイエンティフィック	BP912-100	大腸菌OmniMax細胞の培養
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP1525	溶出ファージ溶液の中和
トリプトンパウダー	フィッシャーサイエンティフィック	BP1421-2	細胞増殖培地成分
トゥイーン 20	フィッシャーサイエンティフィック	BP337500	バッファコンポーネント
酵母エキス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1422-2	細胞増殖培地成分