タンパク質ホモオリゴマー化を研究するための蛍光変動分光法

1. FKBP12 F36V -mVenus Purification

1. モノマー化されたヒトFKBP12F36V12とN末端のHis6およびmVenusタグを含むpET22bベクターで(DE3)pLysS細胞を形質転換します(ベクターはご要望に応じて利用可能)。50 μg/mL のアンピシリンと 34 μg/mL のクロラムフェニコールを添加した LB 寒天上に細胞をプレートします。
2. 形質転換コロニーを100 mL LBスターター培養物に移し、振とうしながら37°Cで16〜20時間増殖します。
3. 高密度スターター培養物(OD600 >1)をLB培地(2 x 500 mLバッチ)で1:100に希釈し、OD600 = 0.6 - 0.8(37°C、200 rpm)まで2〜3時間増殖します。
4. 氷の上でクールな文化。250 μM IPTGで誘導し、21 °C、200 rpmで16〜20時間増殖します。
5. 2,000 x gで20分間遠心分離することにより、細胞を回収します。
6. 40 mLのIMAC緩衝液A(20 mMリン酸ナトリウムpH 7.5、500 mM NaCl、3 mMイミダゾール、1 mMイミダゾール、1 mM β-メルカプトエタノール)にペレットを再懸濁し、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤(1細胞ペレットあたり1錠)を添加します。
7. 氷上で細胞(500ワット、20kHz、振幅40%、9秒オン、11秒オフ15分)を超音波処理し、20,000 x gで遠心分離して可溶性物質を回収します。
8. 可溶性ライセートを円錐形のフラスコに移し、2 mLの樹脂を加えます(材料の表を参照)。105 rpmの回転
   で1時間インキュベートします。 手記：ニッケルセファロースもこのIMACステップに使用できます。
9. レジンを回収し、250 mLのIMAC緩衝液Aで洗浄し、続いて500 mLのIMAC緩衝液B(20 mMリン酸ナトリウムpH 7.5、500 mM NaCl、7 mMイミダゾール、1 mM β-メルカプトエタノール)で洗浄します
   手記： ニッケルセファロース樹脂を使用する場合は、50 mMのイミダゾールに増やします。
10. IMACバッファーC(20 mMリン酸ナトリウムpH 7.5、500 mM NaCl、300 mMイミダゾール、1 mM β-メルカプトエタノール)を使用して、His6タグ付きタンパク質を溶出します。
11. 10 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、および 1 mM DTT で平衡化したサイズ排除カラム(材料表を参照)に注入します。FKBP12F36V使用したカラムでは、ピーク溶出が 87.71 mL です。
12. SDS-PAGEで純度を評価し、必要に応じてプールして濃縮します。

2. マルチウェルプレートアレイの準備

1. 精製したFKBP12F36V(または標識された目的のタンパク質)を-80°Cから解凍します。
2. 100 nM 精製 FKBP12F36V 溶液 (中程度、10 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM DTT) を調製します。超音波処理と遠心分離(13,000rpmの高速回転)を行い、凝集体の形成を防ぎます。
3. 100 - 200 μLをガラス底の8ウェル観察チャンバーにピペット
で移します。
4. BBダイマーを最終濃度10、20、40、80、100、150、300、および500 nMまで添加します。
5. 参考として、100 nMのmVenusのみの溶液を調製して、潜在的な凝集および沈殿効果を評価し、同じ取得設定でモノマーの輝度値を回復します。

3. キャリブレーション不要の共焦点取得

1. 共焦点システムを起動します(図1)。デジタル検出器または十分に特性評価されたアナログ検出器を装備し、取得したすべてのピクセルに対して一定の滞留時間を維持できる光走査型顕微鏡共焦点システムであれば、どれでも機能します。
2. 励起ビームパスを設定します。
   1. 514 nmレーザーをオンにし、対物レンズの出口で20〜100 nWの電力に設定します(FKBP12F36V-mVenusの場合)。
   2. 63X1.4NA対物レンズまたはFCS用に設計されたカラー補正水浸対物レンズを選択します。
   3. HyD、APD、または校正済みPMT検出器を1つオンにします。フォトンカウンティングが可能な検出器が好ましく、この場合、S、オフセット、およびσ₀²の計算は不要である。
   4. 520 - 560 nmの範囲で発光ウィンドウを選択
   5. ピンホールを 1 エアリー単位に設定して、対応する発光 ~545 nm に設定します。
   6. アクイジションモードを16 x 16ピクセルに設定します
   。
   7. ピクセル滞留時間 t_dwell を t_frame >> t d >> t_dwell を満たすように設定します (ここで、_{T D} は拡散タンパク質の滞留時間、t_frame はフレーム レートです)。これは、滞留時間を ~13 μs.
      に設定することに相当します。 手記：一部の商用メーカーは、ピクセルあたりの滞留時間を一定に保たないスキャナーを持っていました。この不変性は、この手法が機能するために重要です。
   8. ピクセル サイズを ~120 nm に設定します。
   9. xyt取得モードを選択し、取得およびウェルごとに取得するフレーム数(たとえば、5,000)を選択します。
   10. システムにハイスループットモードが装備されている場合は、各ウェルの座標とウェルごとの取得数を導入してプロセスを自動化します.
       手記：浸漬対物レンズを使用する場合は、ウォーターディスペンサーの存在を確認するように注意してください。
   11. システムに灌流システムが装備されている場合は、BB溶液をロードし、5000^フレーム目の直後に灌流を開始するようにプログラムして、10,000枚の画像などを取得しながら二量体化の動力学を評価します。
3. FCS用に設計されたカラー補正水浸対物レンズを使用する場合は、油浸対物レンズ/水にオイルを一滴加えます。
4. 8ウェルの観察室をステージに取り付けます。
5. 正しいウェルを選択し、解決策に焦点を当てます。
   手記：重要: 反射や散乱を避けるために、下部ガラスの近くに焦点を合わせないでください。ソリューションに深く焦点を合わせるときは、自動フォーカス オプションを切断します。
6. 取得を開始し、結果の画像のスタックをTIFF形式で保存します。

4. Rパッケージnandbを使用したトレンド除去と輝度分析

1. 前処理の品質チェックとして、ImageJを使用して画像を確認し、図2aに示すように強度プロファイルを回復します。これは、光退色が多すぎたかどうかを判断するのに役立ちます。漂白が多すぎると、データはさらなる分析に適していません.
   手記： ImageJ は、画像を商用形式から TIFF に変換するのにも役立ちます。以下で説明するnandbソフトウェアは、TIFFファイルのみを操作できます。
2. R と RStudio をダウンロードしてインストールします。最初に R をダウンロードしてインストールし、次に RStudio.
   をダウンロードすることをお勧めします 手記：次に、nandb R パッケージの使用方法について説明します。nandbを使用するためにR言語の知識は必要ありませんが、それは生活を楽にします。
3. nandb パッケージをインストールします。
   1. RStudio を開き、コンソールで「install.packages("nandb")」と入力して、インストールを待ちます。
4. nandbについて知る
   1. マニュアルを確認します。
   2. さまざまな機能について、組み込みの RStudio ヘルプを確認します。最も使用される可能性の高い関数は brightness() です。この関数のヘルプファイルを表示するには、「?」と入力します。brightness() をコンソールで呼び出します。
5. 明るさを計算する
   1. デスクトップにimg001.tifという画像ファイルがあるとします( 'nandb'はTIFFファイルでのみ機能することに注意してください)。その画像の明るさを計算できます:
      b <- 明るさ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. これにより、画像の明るさが R の変数 b に割り当てられます。tau = "auto" は、明るさの計算前に画像が正しくトレンド除去されることを保証します。ここから行う最も一般的なことは、画像の平均または中央値の明るさを計算することです。これを行うには、mean(b)またはmedian(b)と入力します。デスクトップに明るさの画像を書き込むこともできます
         ijtiff::write_tif(b, "~/デスクトップ/whatever_img_name")
   2. デスクトップ上にimages_folder画像でいっぱいのフォルダがあり、これらの画像の明るさを計算し、明るさの画像をTIFFファイルとして書き込む必要があるとします。次に、?brightness_folder() を参照してください。この機能は、フォルダ全体を一度に処理します:
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      これは、すべてのファイルが1つのコマンドで処理されるため、Rよりも好むソフトウェアを持っている人にとっては特に良いです。その後、ImageJ、Python、または何か他のソフトウェアで出力輝度TIFF画像で作業を続けることができます。

図 1.溶液中のタンパク質モノマー-ダイマー遷移を検出するためのN&Bの応用。(a)レーザー光源(mVenus標識タンパク質の場合は514 nmに設定)を備えたレーザー走査型顕微鏡(LSM)の簡略化された光路(青矢印)を、FKBP12F36V-mVenus溶液の100 nM溶液を照らす浸対物レンズ(この場合は63X1.4NAオイル)に向けます。発光蛍光(緑の矢印)はダイクロイックミラーを通過し、発光を清めるバンドパスフィルターと、フォトンカウンティングが可能なポイントデジタル検出器の直前にある1エアリーユニットに設定されたピンホールに向けられます。(b)16 x 16ピクセルの照明の共焦点ボリュームをスキャンして、ガウス形状の共焦点ボリュームに出入りする単一のFKBP12F36V-mVenus分子を照らし、蛍光強度の揺らぎの配列を生成します。(c)経時的に取得した画像系列

図 2.溶液中のモノマーの集団を正確に測定するには、自動トレンド除去が必要です。(a) 5000 個の 16 x 16 ピクセルの画像のスタックが、プロトコルのセクションで説明されているように取得されました。最初のフレームの強度は、漂白やその他の溶媒および/または光物理学的効果に関連する可能性のある長期的な変動を示す平均時間分解強度プロファイルとともに表示されます。これらの長期的な変動の原因が何であれ、それらは輝度の計算に影響を与えるため、トレンド除去が必要になります。自動トレンド除去がない場合、B = 1.026 になりますが、自動トレンド除去後は B = 1.005 になります。また、明るさなし(左パネル、2行目)と明るさあり(右パネル、2行目)のスムースフィルタリングが示されています。(b) (a)で示したのと同じデータをトレンド除去し、強度と明るさに関する結果を示しました。