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$$\longrightharp{xx}$$,
1. クローニング
- クローニングする構成を決定し、リンカを選択します。以下に説明するように、N末端またはC末端のフラグメントにタンパク質をタグ付けして、適切な局在を乱さないようにします。(GGGGS)x2 などの柔軟なリンカーを使用します。
- 目的のタンパク質をPAmCherry1フラグメントに遺伝的にタグ付けします。1つの選択肢として、フラグメントRN(PAmCherry1残基1-159)およびRC(MetとPAmCherry1残基160-236)を含む材料リストに記載されているクローニングプラスミドを使用し、MCS配列に隣接します。
- フラグメントRNおよびRCを含むプラスミドを、挿入点でインバースPCR(または制限消化)で直鎖化します。インバースPCRのプライマーを表1に示します。以下は、著者の研究室で使用されたPCRプロトコルの例です(このプロトコルで使用される正確な材料については、材料リストを参照してください)。
- PCR反応を混合し、最終容量を水で50 μlにします:薄肉PCRチューブに水、2x Master Mix25 μL、フォワードプライマーとリバースプライマー各0.5 μl(希釈ストック20 μM、最終濃度0.2 μM)、テンプレート1 ngを加えます。次のサイクル条件を使用します:98 °Cで30秒間、98 °Cで7秒間、68 °Cで2分間のサイクルを30回、最後に72 °Cで10分間延長します。
- RNおよびRCフラグメントを含む直鎖状プラスミドへの挿入対象遺伝子をPCR。ステップ 1.2.1 と同様に、延長時間を 68 °C で PCR を実行します。(GGGGS)x2 の GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT などの柔軟なリンカー配列を含むオーバーハングを持つプライマーを使用し、組換えのために直鎖化された RN および RC プラスミドの末端に 15 塩基対の相同性を使用します。
手記： 目的のタンパク質のプライマーオーバーハングは、表1のプライマーを使用してプラスミド骨格を直鎖化する場合に表2に示されています。
- PCR反応をDpn1で消化し、PCRテンプレートを除去します。0.5 μl の Dpn1 (20 U/μl) を PCR 反応液 50 μl に直接添加します。37°Cで1時間インキュベートし、80°Cで20分間加熱不活性化します。バックグラウンドテンプレートが後のステップで持続する場合は、酵素の量を増やすか、消化時間を長くします。
- PCR産物をスピンカラムで精製します(製造元の説明に従って)。
- ライゲーション非依存性反応を行い、RNまたはRCフラグメントを含む直鎖状プラスミドを目的の遺伝子と組み合わせます。精製したPCR産物の濃度を測定する:50 ngの直鎖状プラスミドと50 ngの目的の遺伝子を1 μlの酵素プレミックスと組み合わせ、脱イオン水で総容量を5 μlにします。50°Cで15分間インキュベートし、氷上に置いて、TEバッファー20μlを加えます。
- 組換えプラスミドをコンピテントバクテリアに変換します。
- O/N培養用の2-4+(必要に応じて)コロニーを選択します。14 mLのポリプロピレン丸底チューブに5 mLのLBブロスと5 μlのカナマイシン(50 mg/mlストック)を加え、選択した細菌コロニーを滅菌した接種ループで追加します。225 rpmで振とうしながら、37°C O/Nでインキュベートします。
- 1 mLのO / N培養物をグリセロールストック用に凍結し、残りをメーカーの説明に従ってミニプレップします。
- シーケンシングを実行して、良好なクローンを特定します。Materials Listのクローニングプラスミドを使用する場合は、必要に応じてM13フォワードプライマーとリバースプライマーを(別々の反応で)使用して、融合コンストラクトの完全な配列を取得します。National Center for Biotechnology Information(NCBI)のBLASTなどのアライメントツールを使用して、予想される配列と比較します http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi。
- 配列検証済みのコンストラクトを、リコンビナーゼ反応を介して発現プラスミドに移します。
- 75 ngのデスティネーションプラスミド(一過性トランスフェクション用のpcDNA、レンチウイルスパッケージング用のpLentiなど)と50 ngの組換えクローニングプラスミドを1 μlの酵素プレミックスに加え、脱イオン水で総容量を5 μlまで増やします。25°Cで1時間インキュベートした後、TEバッファー5μlを加えます
手記： レンチウイルスのパッケージングと安定した細胞株の作製のためには、各コンストラクトに異なる目的地プラスミドを使用します(例えば、1つはピューロマイシン耐性、もう1つはネオマイシンです)。これにより、形質導入細胞を二重に選択することができます。また、高発現レベルの構成的サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターや、ドキシサイクリン調節可能な発現のTetOオペレーターを持つCMVなど、それぞれのプロモーターも考慮してください。
- 5 μlをコンピテントバクテリアに形質転換し、ステップ1.2.6から1.2.8のようにプラスミドをミニプレップしますが、適切な抗生物質 (通常はアンピシリン) を使用します。
- 最適な BiFC 構成を決定します。
- 発現プラスミドをU2OS細胞(または選択した細胞)にコトランスフェクションします。
フェ- ノールレッドフリーおよび抗生物質フリーのDMEMを10% FBSを添加した350 μlを、8ウェル#1.5ガラスボトムチャンバースライドの各ウェルに加えます。ウェルあたり約7.5 x 104個の細胞をプレート化して、翌日に細胞が約70%〜90%コンフルエントになるようにします。
- プレーティングの翌日、各ウェルで異なる構成の発現プラスミドを、好ましい試薬を使用し、メーカーが説明したとおりにトランスフェクションします。
- 各ウェルについて、各発現プラスミド125 ngを0.6 mLチューブ内の無血清還元培地50 μlに加え、ピペットで上下に動かして混合します。トランスフェクション試薬1 μlをチューブの中央に含み、直接培地に注入します。穏やかに攪拌して混合し、反応を30分間放置します。
- チャンバースライドの各ウェル内のメディアを約半分に減らします。トランスフェクション混合物をウェルに滴下し、穏やかに振って混合します。細胞を37°Cおよび5%CO2で24〜48時間インキュベートします。トランスフェクションの翌日に培地を交換してください。
- ステップ2.1.4.
から始まるプロトコル2と同様に、蛍光顕微鏡で細胞を画像化します
手記：発現レベルが高く、カメラがPAmCherry1の比較的低い光子出力に対して十分な感度を持っている場合、サンプルは標準的な蛍光顕微鏡でイメージングできます。再構成されたPAmCherry1分子は、緑色励起(561 nm)フィルターセットでイメージングする前に、紫外線フィルターセット(405 nm)で活性化できます。
- 該当する場合は、例えば、相互作用を阻害する目的のタンパク質の1つに点突然変異を導入することにより、ネガティブコントロールを作成します。変異するタンパク質および選択した構成のクローニングプラスミドに対して部位特異的突然変異導入を行います。
- コンストラクトをウイルス粒子にパッケージングし、U2OS細胞(または選択した細胞株)に感染させることにより、安定した細胞株を作製します。BiFCの長期にわたる不可逆性が問題となる場合、または調整可能な発現が望まれる場合に、イメージング前に発現を誘導できるように、誘導性(テトラサイクリン)発現システムを検討してください。
注意：ウイルスの取り扱いは、バイオセーフティレベル2に分類されます。近年のウイルスパッケージングシステムにより、複製能力のあるウイルスが産生される可能性は大幅に減少しましたが、依然としていくつかのリスクが存在します。参考文献は http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/にあります。
- 手順1.2.10を繰り返し、レンチウイルスまたはレトロウイルスのデスティネーションベクターを使用します。O/N培養液を100 mLに増やして、プラスミドの純度を高めます。
- 1日目:約2 x 106 293T/17細胞を、包装する各コンストラクトの10cm皿にプレートします。
- 2日目:選択したトランスフェクション試薬を使用して、メーカーの説明に従ってトランスフェクション反応を準備します。
- プラスミド1および2の包装用最終濃度が250 ng/μl、プラスミド3の包装用100 ng/μlの包装プラスミドのプレミックスを滅菌水で調製します。5 mLのポリプロピレン丸底チューブに、10 μlのパッキングプラスミドプレミックスと2.5 μgのターゲットプラスミドを1 mLの無血清還元培地に加え、ピペットで上下に動かして混合します。20 μlのトランスフェクション試薬をチューブの中央に下ろし、直接培地に加えます。
- 穏やかに撹拌して混合し、室温で30分間インキュベートし、培地を細胞から約半分取り出し、トランスフェクション混合物を滴下します。穏やかに振とうして混合し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。プレートあたり10 mLの培地をチューブ内でインキュベートし、温度とCO2平衡のためにキャップを緩めます。
- 3日目:インキュベート済みの培地で培地を静かに交換し、細胞をインキュベーターに戻します。キャップを緩めた状態で、別の培地チューブをインキュベートします。注:Syncytia、または大きな多核細胞の形成は、パッケージングが順調に進んでいる兆候である可能性があります。しかし、細胞は壊れやすい状態にあり、簡単に剥がすことができます。メディアを交換するときは、ピペッターを水平になるように傾け、メディアをプレートの一方の端にドロップワイズに追加します。
- 4日目:シリンジで培地を取り出し、0.45μmの孔径フィルターでろ過してきれいな50mlチューブにウイルスを採取します。培地をインキュベート済みの培地と静かに交換します。
- 5日目:ステップ1.5.3.3で以前に行ったように再度収穫し、一般的な濾液を同じ50mlチューブに混ぜ合わせます。各チューブに6mlのウイルス濃縮器を加えて混合します。ウイルスが沈殿するまで、4°Cで少なくとも24時間保存してください
手記： 細胞の健康状態にもよりますが、ウイルスは3回目に採取することができます。
- 1,500 x g、4°C、15分間遠心分離してウイルスを濃縮し、上清を吸引し、ペレットを250 μlの培地に再懸濁します。ウイルスは、すぐに感染に使用することも、-80°Cで50μlのアリコートに最大1年間保存することもできます。
- ウェルあたり約3 x 105 U2OS(または標的)細胞を6ウェルプレート(ウェルあたり10%FBSを含む2 mlのDMEM)に播種して感染させると、感染時に細胞が約50%コンフルエントになります。
- 翌日、約1mlが残るようにメディアを約半分取り出します。各コンストラクトに50 μlの濃縮ウイルスを共感染させます。各ウェルにポリブレン (8 mg/mL) 1 μl を加えます。37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。翌日培地を交換し、抗生物質を選択する前にさらに1日インキュベートしてください.
手記： 追加するウイルスの量は、希望する感染率によって異なります。ウイルスはqRT-PCRを使用して滴定できます。
- 抗生物質を添加して感染細胞を選択します。ウイルスを検出していない未感染の細胞を含む別々のウェルは、選択の有効性をテストするためのカナリアとして必要です。2〜7日間、または選抜が完了するまでインキュベートします
手記： 有効濃度は最初に滴定する必要がありますが、通常、ピューロマイシンは1.0 μg/ml、ネオマイシンは1.0 mg/mlです。
- 細胞をより大きな10cmの皿に拡張し、プロトコル2に進みます。
2. 固定細胞のイメージング
- イメージング用のサンプルを調製します
- 8ウェル#1.5ガラス底チャンバースライドを1M NaOH250μlで少なくとも1時間加えて洗浄し、PBS.
で十分に洗浄してください
手記： 未処理のチャンバースライドは、通常、バックグラウンドシグナルが高くなります。さらに、細胞は残留NaOHに感受性がある可能性があり、ガラス表面を完全に洗浄しない(10回も洗浄する)と、細胞の接着が困難になる可能性があります。必要に応じて、洗浄後に洗浄したチャンバースライドをPBS O/Nでインキュベートします。感受性細胞株の場合、より高い密度(例えば、50%-60%の初期コンフルエント)でのプレーティングが役立つ場合があります。
1- ウェルあたり約5.5 x 10 4個のU2OS安定発現細胞を、10% FBSを含む350 μlのフェノールレッドフリーDMEMにプレート化して、イメージング時に細胞が健康で過度にコンフルエントにならないようにします。
- テトラサイクリンを添加してタンパク質発現を誘導するなど、実験に必要な処理を行います。
- イメージングの直前に細胞を固定します。
- 固定する前に、新鮮なパラホルムアルデヒド(PFA)溶液(3.7% PFA、1x PHEM溶液、0.1%グルタルアルデヒド(GA))を調製します。10 mLのPFA溶液の場合、0.37 gのPFAを秤量し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。蒸留水1 mLと1 M NaOHおよびボルテックス30 μlを加えます。70°Cで加熱し、PFAが完全に溶解するまで1〜2分ごとに渦
巻きます。
- 溶解したPFAを15 mLのコニカルチューブに移し、蒸留水3.8 mL、2x PHEM buffer5 mL、25%グルタルアルデヒド20 μl、ボルテックスを加えて混合します。ストックの2x PHEMバッファーは、120 mM PIPES、50 mM HEPES、20 mM EGTA、および16 mM MgSO4で、pHは10 M KOHで7.0に調整されています。この固定液は、4°Cで数日間保存できます.
注意：PFAとGAはどちらも危険です。ヒュームフードで溶液を調製し、両方の化学物質を取り扱うときは適切な保護具を着用してください。吸入や直接の皮膚接触を避けてください。
- 成長培地を取り出します。500 μlのPBSですばやく洗浄し、ウェルごとに250 μlのPFA固定液を加えます。細胞を室温で20分間インキュベートします。
- サンプルからPFA固定液を取り出し、ウェルあたり350 μlのPBSまたはイメージングバッファー(100 mM Trisと30 mM NaClおよび20 mM MgCl2、pH 8.5)を加えます。
- 100 nmの金粒子をボルテックスして凝集体を分解し、ウェルあたり35 μl(最終希釈の10倍)を添加して、イメージング中のステージドリフトを追跡します。
- 画像を取得する
- 顕微鏡の電源を入れます。405 nm レーザーと 561 nm レーザーの電源を入れますが、この時点ではシャッター (内部または外部) を閉じたままにします。EMCCDカメラの電源を入れ、冷まします。561 nm フィルターが所定の位置にあることを確認します。
- 集録ソフトウェアを開き、露光時間を100ミリ秒に、EMCCDゲインを300(範囲1〜1,000)に設定します。
- 対物レンズに液浸油を加え、サンプルを顕微鏡ステージに固定します。
- 明視野または561nmレーザー(~1 kW/cm2)を使用して、サンプルに焦点を合わせます。
- Rasやその他の膜タンパク質のイメージングには、開口数1.49の60倍アポクロマートTIRF対物レンズを使用し、顕微鏡をTIRF構成にします。励起レーザーを調整して、TIRF対物レンズの後部開口部に当たるときに中心から外れるようにします。これにより、サンプルに到達するとレーザーが偏向します。臨界角度に達し、レーザーが反射されるまで、レーザーを調整し続けます。いくつかの金の粒子が表示されている画像を撮像するセルを検索します。セル (またはセル内の領域) と金の粒子を囲む関心領域を設定します。
注:TIRFは、励起レーザーの透過深度を減少させ、焦点が合っていない背景信号を減少させます。さらに、ドリフト補正は、より多くの金粒子が視界に入ると、より正確になる可能性があります。
- 可能な場合は、オートフォーカスシステムを使用して、z方向のサンプルドリフトを補正します。それ以外の場合は、画像の焦点が合わなくなった場合は、取得中に手動でフォーカスを調整します。
- 十分な活性化がすでに発生している場合(通常は発現レベルが高い場合)は、405 nmレーザーをオフにし、561 nmレーザーをオン(~1 kW/cm2)にして取得を開始します。それ以外の場合は、405 nm レーザーを工場出力の最低設定 (0.02 mW または 0.01 W/cm2) でオンにし、必要に応じて (一度に 0.1 mW ずつ) フレームあたり数十分子になるまで、または単一分子が十分に分離されるまで
増やします。
- データ集録が進むにつれて、405 nmのレーザー出力を徐々に増やして、スポット密度をほぼ一定に保ちます。注:405 nmの低励起電力では、一部のPAmCherry1がすでにアクティブになっている可能性があります。これらの分子が光退色すると、残りの光活性化可能なPAmCherry1分子の集団が減少するため、各フレームで蛍光を発する分子の密度を同じに保つためには、より高い光子束が必要になります。
- 高405 nmの高出力(2.5 – 10 W / cm2)がそれ以上の活性化イベントをアクティブにしないまで、画像取得を続けます。
手記： 合計取得時間は、相補の発現レベルと効率によって異なります。
>表 1.PAmCherry1フラグメントを含むクローニングプラスミドを直鎖化するためのプライマー。RNおよびRCを含むクローニングプラスミドは、フラグメントのN末端またはC末端のいずれかに挿入する点でインバースPCRで直鎖化できます。配列は 5' から 3' にリストされています。
| プライマー配列(5'から3') |
| N末端逆転に挿入したクローニングプラスミド | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| 北端前方のRN | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RCはN終点前方にあります | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| C末端前方に挿入するためのクローニングプラスミド | TAAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| C末端からのRNリバース | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| C末端からのRCリバース | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
>表 2.表1のプライマーと一致する目的の遺伝子プライマーのオーバーハング。
ライゲーションに依存しない反応の15塩基対の相同性は、プライマーオーバーハングから生成されます。さらに、オーバーハングには(GGGGS)x2フレキシブルリンカーの配列が含まれています。代わりに、柔軟なリンカー配列を表1のプライマーに追加することができます。配列は 5' から 3' にリストされています。
| 目的遺伝子プライマーのオーバーハング(5'〜3') |
| N端子挿入RNまたはRCフォワード | GAGCTCGGタックキャット |
| N端子挿入 RNリバース | ACTTCCACCTCCACCACCTC
CACCTCCCTCTCGCCCTTGCTCAC |
| N端子挿入RCリバース | ACTTCCACCTCCACCACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C端子挿入RNフォワード | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C端子挿入RCフォワード | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C端子挿入RNまたはRCリバース | GCGCCCACCCTTTTA |