$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. FlAsH蛍光色素4',5'-ビス(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) FluoresceinによるSBDS-FlAsHの標識
- SBDS-FlAsHタンパク質(FlAsHタグは、組換えSBDSタンパク質のC末端に遺伝子操作されたテトラシステインモチーフCys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cysに対応します)の3 nmolと4',5'-ビス(1,3,2 dithioarsolan-2-yl)フルオレセイン色素の3 nmolを5 μlの容量の異方性バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.5、300 mM NaCl、5 mM MgCl 2、5 mM MgCl2)に混合します。 10% グリセロール、5 mM β-メルカプトエタノール)
- 反応を4°Cで8時間進行させ、異方性緩衝液に対してサンプルを一晩透析して遊離色素を除去します。
- ランバート・ビールの法則を使用して、標識タンパク質の割合を定量します。280 nmと508 nmの吸光度を、適切な容量の石英キュベットを使用して分光光度計で測定します。手記：次のモル吸収係数(M-1 cm-1)を考えてみましょう:
方程式 1
- 標識SBDS-FlAsHタンパク質の濃度を式2.
を使用して計算します。
方程式 2
- 式 3 を使用して、前のステップで計算した C SBDS-FlAsH を代入して、総 SBDS タンパク質の濃度を計算します。
方程式 3
- 式 4.
を使用して標識タンパク質の割合を計算します
数式 4
2. 蛍光異方性実験
>注:異方性実験は、偏光ツールボックスを備えた分光蛍光光度計で行い、データ収集は機器のソフトウェアで提供されている異方性プログラムを使用して行いました。励起波長は494 nm、スペクトル帯域幅は8 nmに設定され、発光は530±25 nmのバンドパスフィルタを使用して記録されました。測定は、光路長5 mmの200 μlキュベットで25°Cで行いました。
- 蛍光キュベットに、200 μlの30 nM SBDS-FlAsHを異方性バッファーに入れ、2 μlの30 μM EFL1を滴定します。十分に混合し、反応を3分間放置してから、異方性値を測定します。
- ステップ2.1を繰り返して、総容量40 μlのEFL1を添加します。
3. データ分析
- 非線形最小二乗回帰アルゴリズムを使用して、データを適切なバインディング モデルに適合させます。最も一般的な結合モデルの方程式を表 1 に示します。
- 適合値の残差を検査することにより、タンパク質間の相互作用を記述する最適なモデルを評価します。選択したモデルを追加の実験でサポートします。
>表 1.一般的なタンパク質間相互作用結合モデルとそれらを記述する数式。
