転写因子-DNA複合体の検出のための電気泳動移動度シフトアッセイ

要約

出典: Hsieh, Y. W. et al., An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、赤外線蛍光標識DNAプローブを使用してタンパク質-DNA相互作用を検出する電気泳動移動度シフトアッセイを実演します。タンパク質がDNAプローブに結合すると、大きな複合体が形成され、ゆっくりと移動し、ゲル上にシフトしたバンドとして現れます。

プロトコル

1. 結合反応と電気泳動

1. 50 μL の 1 M Tris-HCl、pH 7.5、10 μL の 5 M NaCl、200 μL の 1 M KCl、5 μL の 1 M MgCl₂、10 μL の 0.5 M EDTA、pH 8.0、1 μL の 1 M DTT 5 μL、25 μL の 10 mg/mL BSA を混合して、1x 結合バッファー 1 mL を調製します。 695 μL の ddH₂O.
   手記： 5x Binding Bufferは、分注して-20°Cで保存することができます。考慮すべきもう一つの点は、転写因子が異なれば、結合バッファーに異なる修飾が生じることです。
2. 結合反応を設定する直前に、5%天然ポリアクリルアミドゲルを0.5x TBE + 2.5%グリセロールで事前に実行し、80 Vで30〜60分間、または電流が時間とともに変化しなくなるまで、微量の過硫酸アンモニウムを除去します。
3. 結合反応を最終容量20 μLで設定します。
   1. 4 μL の 5x 結合バッファー、80 - 200 ng の精製タンパク質 A (50% グリセロール、すなわち SOX-2)、1 μL の 0.1 μM 色素標識プローブ (最終濃度: 5 nM)、ddH₂O を混合します。
   2. オプション:コールドプローブの競合製品が必要な場合は、さまざまな濃度(2倍、10倍、25倍、50倍、100倍など)のコールドプローブを追加します。
   3. オプション:タンパク質AとB(SOX-2とLIM-4)の相互作用を試験する場合は、80〜200 ngの精製タンパク質B(50%グリセロール、つまりLIM-4)を追加します。
   4. オプション:核抽出物調製物を使用し、プロテインAの特異的結合を検証する場合は、プロテインAに特異的な抗体(抗6xHis、抗FLAGなど)を添加します。
   5. R/Tで暗所で15分間インキュベートします。
4. すべての結合反応をゲルにロードし、ゲルを10 V/cmで目的の距離まで泳動します。

2. イメージング

>注:ゲルは、高度な赤外線イメージングシステムを使用してガラスプレート内で直接スキャンされました。したがって、ゲルをさらに分離し、繰り返しスキャンすることができます(図1Cおよび2)。ゲルをスキャンするために、主にウェスタンブロット用の近赤外蛍光イメージングシステムも試験しましたが、ゲルを良好な解像度でスキャンできたのは高度な赤外線イメージングシステムだけでした。説明されている方法論は、特定の赤外線イメージングソフトウェアに固有のものですが、他のソフトウェアパッケージを使用することもできます。

1. スキャナーのベッドをddH₂Oで清掃し、スキャンする前によく乾かします。ゲルのガラスプレートを拭いて乾かし、ゲルの入ったプレートをスキャナーベッドに置きます。
2. 赤外線イメージングソフトウェアを開き、[取得]タブに移動します。薄いプレート(1mm)をスキャナーベッドにセットする場合は、チャンネル:700、強度:オート、解像度:169μm、品質:中、フォーカスオフセット:1.5mmの設定で行います。厚いプレート(3 mm)をスキャナーベッドにセットする場合は、[チャンネル]:700、[強度]:[自動]、[解像度:84 μm]、[品質:中]、[フォーカスオフセット:3.5 mm]の設定を使用します。フォーカスオフセットは、ガラス板の厚さによって異なります。
3. スキャナー上でゲルが占める領域を選択します。「開始」をクリックしてスキャンを開始します。

結果

図 1.fEMSA 赤外蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを使用。 (A)fEMSAのフローチャート。(B)ブロモフェノールブルー色素、オレンジG、およびdI-dC(1μg)のfEMSAへの影響。5 nM の 5'Dye-LIM-4/SOX-2 プローブを使用しました。(C)6xHis-SOX-2^G73EのLIM-4/SOX-2エレメントのSOX-2標的部位への結合特異性を示すfEMSA5 nM の 5'Dye-LIM-4/SOX-2 プローブを使用しました。LIM-4/SOX-2(M)、変異標的部位。ゲルは、電気泳動の20分後および40分後にスキャンしました。電気泳動の40分後に得られたスキャン画像を使用して、蛍光バンド強度を定量化しました。これは、コールドプローブを使用しないレーンの強度によって正規化されました。AU、任意の単位。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
30% アクリルアミド/ビス溶液、37.5:1	バイオ・ラッド	1610158	アクリルアミドは有害で有毒です。
ウシ血清アルブミン分子生物学グレード	ニューイングランドバイオラボ	B9000Sの
5'IRDye700標識DNAオリゴ	統合DNAテクノロジー	カスタムDNAオリゴ	これらは、原稿では5'色素標識または赤外蛍光色素標識DNAオリゴと呼ばれています。同社は、5' IRDye標識DNAオリゴヌクレオチドをカスタム合成します。最低100μMスケールの合成とHPLC精製が必要です。
Mini-PROTEAN 垂直電気泳動セル	バイオ・ラッド	1658000FC	デバイス
オデッセイ CLx 赤外線イメージングシステム	LI-CORバイオテクノロジー	オデッセイ CLx 赤外線画像システム	デバイス
オデッセイ FC イメージングシステム	LI-CORバイオテクノロジー	オデッセイ FC デュアルモードイメージングシステム	デバイス
Image Studioソフトウェア(バージョン4.0)	LI-CORバイオテクノロジー	Image Studioソフトウェア	ソフトウェア
オレンジG	シグマ・アルドリッチ	O3756-25G	ケミカル
6xオレンジローディング染料			オレンジ 0.25% G、グリセロール 30%
0.5倍TBE			45 mM トリスホウ酸、1 mM EDTA
1 x TE			10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH8.0
1x STE			100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH8.0、1 mM EDTA
5xバインディングバッファー			50 mM Tris-HCl、pH7.5、50 mM NaCl、200 mM KCl、5 mM MgCl2、5 mM EDTA、pH8.0、5 mM DTT、250 ug/ml BSA