ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

要約

出典:Dong, X., et.al., 低細胞クロマチン免疫沈降シーケンシング解析による急性精製PDGFRα+細胞における転写因子Olig2ゲノム結合部位の同定。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウス脳からのPDGFRα陽性オリゴデンドロサイト系統細胞の精製(以前に記載された免疫パニングプロトコルから改変)

1. PDGFRα陽性細胞選択のための免疫パニングプレートと、内皮細胞とミクログリアの枯渇のための2つのプレートの調製。
   手記：ペトリ皿は、細胞培養皿ではなく、免疫パニング実験には有効ではないことに注意してください。精製した細胞を培養に使用する場合は、バイオセーフティキャビネット内でイムノパニング手順を実施する必要があります
   1. 10 cmのペトリプレートに30 μLのヤギ抗ラットIgGを10 mLのpH 9.5、50 mM Tris-HClで一晩4°Cでコーティングします。
   2. 40 μL のラット抗 PDGFRα 抗体を 0.2% BSA を含む 12 mL のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で希釈して、PDGFRα 抗体溶液を調製します。
   3. IgGコーティングプレートを10 mL 1x DPBSで3回洗浄した後、IgGコーティングプレートをPDGFRα抗体溶液と室温で4時間インキュベートします。
   4. ラット抗PDGFRα抗体コーティングプレートを、それぞれ1x DPBS10 mLで3回洗浄します。プレートの側壁に沿ってDPBS溶液を静かに追加し、コーティングされた表面を乱さないでください。
   5. 内皮細胞とミクログリアの枯渇のために、2.3 μg/mLのBanderiaea simplicifolia lectin 1 (BSL-1) を含む20 mLのDPBSを2時間塗布します。
   6. BSL-1コーティングプレートを20mLの1x DPBSで3回洗浄します。プレートの側壁に沿ってDPBS溶液を静かに追加し、コーティングされた表面を乱さないようにします。
2. PDGFRα陽性オリゴデンドロサイト系統細胞の精製は、以前に発表された方法から改変されています。
   1. 以前に発表されたプロトコルに従って、出生後 2 日目 7 (P7) マウスの脳から皮質組織を解剖します。
   2. 詳細な製造元の指示に従って、神経組織解離キット(P)で組織を解離して単一細胞懸濁液を生成します。
   3. 簡単に、解剖した皮質組織をメスで細かく切り取り、37°Cで酵素消化にかけます。消化後、ファイヤーポリッシュガラスパスツールピペットでピースを手動で解離し、シングルセル懸濁液に入れます。
   4. 単一細胞懸濁液を室温で300 x gで10分間遠心分離し、15 mLの免疫パニングバッファー(免疫パニングバッファーは0.02% BSAおよび5 μg/mLインスリンを含むDPBSです)を使用して細胞ペレットを懸濁します。
   5. 2 つのマウス脳からの 1 細胞懸濁液を 2 つの BSL-1 コーティング プレート上で室温で 15 分間順次インキュベートし、プレートを 5 分ごとに穏やかに攪拌して、ミクログリアと内皮細胞の枯渇を改善します。
   6. プレートを静かに渦巻かせて、細胞懸濁液中の非接着性細胞を回収し、ラット-PDGFRα抗体コーティングプレート上で室温で45分間インキュベー
   トします。
   7. ラット-PDGFRα抗体コーティングプレート上で細胞懸濁液をインキュベートした後、プレートを穏やかに渦巻かせて細胞懸濁液を収集し、プレートをDPBSで8回すすいで非接着性細胞を取り除きます。プレートの側壁に沿って洗浄液を静かに加え、プレートを数回攪拌して、非接着性細胞を取り除きます。
   8. ラット-PDGFRα抗体コーティングプレートから細胞を剥離し、4mLの細胞剥離溶液処理を37°Cで10分間行い、プレートを振って付着細胞を剥離します。
   9. 精製したOPCを室温で300 x gの遠心分離により収集し、細胞ペレットを2 mLのOPC細胞培養培地で懸濁し、トリパンブルーと血球計算盤(5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液(P / S)、5 mL N2、10 mL B27、10 mLを含むDMEM / F12培地中の500 mL細胞培養培地)を使用して細胞をカウントします。 5 μg/mL インスリン、0.1% BSA、20 ng/mL bFGF、10 ng/mL PDGFRα)。
3. イムノパニング後のOPCの純度の検証。
   1. イムノパニング後のOPCの濃縮を評価するには、精製されたOPCの一部を、製造元の指示に従ってチオシアン酸グアニジウムベースの抽出によるRNA抽出に使用します。
   2. 蛍光グリーン色素マスターミックスを使用してqRT-PCRを実施し、精製されたOPCにおけるPDGFRα発現の濃縮度を、以前に発表された材料に従って解離した脳細胞と比較して確認します。
   3. さらに、精製したOPCの一部をPoly-D-Lysineコーティングした24ウェルプレートにシードし、以前に発表された材料として抗NG2コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(NG2)抗体で免疫染色します。

2. ハイスループットシーケンシングのための低細胞ChIP調製とChIPライブラリ構築

1. 市販の超音波処理システムと市販の低細胞数ChIPキット(材料の表を参照)を使用したOlig2低細胞ChIP調製は、製造元の指示書の詳細な標準手順に従ってください。
   1. ラット抗PDGFRα抗体コーティングプレートから分離し、トリパンブルーと血球計算盤で細胞計数した後、ChIP反応ごとに1 mLのOPC細胞培養培地に20,000個の精製OPCを入れました。
   2. 27 μL の 36.5% ホルムアルデヒドを加えて、細胞懸濁液を室温で 10 分間固定します><。 注意：安全上の理由から、化学薬品ドラフトにはホルムアルデヒドを使用する必要があることに注意してください。
   3. 50 μL 2.5 MグリシンによるDNA-タンパク質架橋を室温で5分間停止します
      手記：すべてのステップは、この時点から氷上または4°Cの冷蔵室で実行する必要があります。
   4. 架橋細胞ペレットを氷冷したハンクス平衡塩溶液(HBSS)1 mLとプロテアーゼ阻害剤カクテルで洗浄し、予冷した遠心分離機(300 x g、4°C)で細胞をペレット化します。
   5. 細胞ペレットを25 μLの完全Lysis Bufferで氷上で5分間溶解します
      手記：チューブを攪拌して、細胞をLysis Bufferに懸濁します。
   6. プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む75 μLの氷冷HBSSで細胞ライセートを補充し、30秒オンおよび30秒オフプログラムの5サイクルで予冷超音波処理システムにより細胞ライセートのクロマチンをせん断します。常に6本のチューブを一緒に超音波処理し、バランスチューブに100μLの水が含まれていることを確認してください。
   7. 剪断後、14,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、遠心分離後に新しいチューブに上清を回収します。
   8. 剪断したクロマチン100 μLを、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷した完全ChIPバッファーと同量の希釈してください。
   9. 希釈したせん断クロマチンの20 μLをインプットコントロールサンプルとして保存します.
      手記：Olig2抗体免疫沈降DNAを同定するためのOlig2免疫沈降サンプルとの比較として、インプットコントロールサンプルも必要です。
   10. 希釈した剪断クロマチン180 μLに1 μLのウサギ抗オリg2抗体を加え、反応チューブを回転ホイール上で40 rpm、4 °C、16時間インキュベートします< br /> 手記：この手順は、冷蔵室で実行します。
   11. 各ChIP反応について、磁性タンパク質Aコーティングビーズ11 μLを55 μL Beads Wash Bufferで洗浄し、2回の洗浄後にビーズペレットをビーズ洗浄バッファー11 μLに入れてください><。 手記：この手順は、冷蔵室で実行します。
   12. 各ChIP反応について、事前に洗浄したProtein Aコーティングビーズ10 μLをChIP反応チューブに加えます。この手順は、冷蔵室で実行します。
   13. ChIP反応チューブを4°Cで回転ホイール上でさらに2時間インキュベー
   トします。
   14. ChIP反応チューブを磁気ラックに1分間置きます.
       手記：この手順は、冷蔵室で実行します。
   15. 上清を取り除き、ビーズペレットを取り除かないでください。
   16. ビーズペレットを4つの洗浄バッファーのそれぞれについて100 μLで、回転するホイールで4°Cで4分間洗浄します。
   17. 洗浄後、ビーズペレットに200 μLの溶出バッファーを加え、ChIP反応チューブを65°Cで4時間インキュベートして、タンパク質-DNAを逆架橋します。
   18. さらに、180 μLの溶出バッファーを20 μLのインプットコントロールサンプルに加え、65°Cで4時間インキュベートして、タンパク質DNAを逆架橋します。
   19. フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの25:24:1 (v/v) 混合物を200 μL 200 μL
   加えます。
   20. 1分間激しくボルテックスし、室温で15分間13,000 x gで遠心分離します。上相を新しいチューブに移します。
   21. 3 M酢酸ナトリウム溶液40 μL、100%エタノール1,000 μL、および青色色素に共有結合したグリコーゲン沈殿剤2 μLを各ChIP反応チューブに-20°Cで一晩加えます。
   22. 13,000 x gで4°Cで20分間遠心分離します。
   23. 上清を捨て、500 μLの冷70%エタノールで洗浄し、13,000 x gで4°Cで20分間遠心分離します。
   24. 上清を捨て、ペレットを10分間空気乾燥させ、ペレットを50μLの水で溶解します。
2. ハイスループットシーケンシングのためのChIPライブラリ構築
   1. 製造元の指示に従って、クリーンアップキットでChIP DNAを洗浄し、濃縮してください。
   2. 製造元の指示に従って、ピコグリーンでChIPサンプルを定量してください。
   3. T-テーリング、レプリケーション、テーリング、テンプレートの切り替えと伸長、アダプターと増幅の追加、ライブラリサイズの選択、および製造元の指示に従って精製するには、ChIP-seqキットを使用してください。
      1. dsDNAを変性させた後、エビアルカリホスファターゼによりssDNAの3'末端を脱リン酸化し、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりssDNAにポリ(T)テールを付加します。
      2. DNA Poly(dA)プライマーをssDNAテンプレートにアニールして、DNA複製とテンプレートの切り替えを行います。
      3. テンプレートの切り替え後、インデックス作成のためにフォワードプライマーとリバースプライマーを使用したPCRにより、ChIP-seqライブラリを増幅します。
      4. 常磁性ビーズによる250 bpから500 bpの範囲のフラグメントを含むPCR増幅ChIP-seqライブラリーを、オプション2のダブルサイズ選択で選択してください。
      5. 選択したChIP-seqライブラリの品質を、マイクロ流体チップキャピラリー電気泳動デバイスを用いて検討します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬・装置
Banderiaea simplicifolia レクチン1	ベクターラボラトリーズ	#L-1100
ラット抗PDGFRa抗体	BDバイオサイエンス	# 558774
神経組織解離キット(P)	MACSミルテニーバイオテック	#130-092-628
アキュターゼ	STEMCELLテクノロジー	#07920
トリゾール	サーモフィッシャー	# 15596026
抗NG2 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体	ミリポア	#AB5320
Bioruptor Pico超音波処理装置	ダイアゲノード	# B01060001
真のMicroChIPキット	ダイアゲノード	# C01010130
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1, v/v)	サーモフィッシャー	# 15593031
NucleoSpin ゲルおよび PCR クリーンアップキット	マシェリー・ナーゲル	# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA アッセイキット	サーモフィッシャー	#P11496
DNA SMART ChIP-Seqキット	クロンテックラボラトリーズ	# 634865
アジャンクール アンプレXP	ベックマン・ヴォーター	#A63880
グリコブルー	サーモフィッシャー	#AM9516
ピコグリーン	サーモフィッシャー	#P11496
D-PBSの	サーモフィッシャー	#14190-144
SYBRグリーンマスターミックス	バイオ・ラッド	# 1725124
DMEM/F12	フィッシャーサイエンティフィック	#11-320-033
ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)	フィッシャーサイエンティフィック	# 15140122
N-2サプリメント	フィッシャーサイエンティフィック	# 17502048
B-27 サプリメント	フィッシャーサイエンティフィック	# 17504044
インスリン	シグマ	#I6634	5 mgのインスリンを10 mLの水と50 μlの1 N HClに溶解して、0.5 mg / mlのインスリン溶液を調製します。.
細胞培養に適したウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ	#A4161	4 g BSAを100 mL D-PBSに溶解して4% BSA溶液を調製し、pHを7.4に調整します
線維芽細胞増殖因子 塩基性タンパク質、ヒト組換え体(bFGF)	EMDミリポア	#GF003
ヒトPDGF-AA	VWRの	#102061-188
ポリ-D-リジン	VWRの	# IC15017510	10 mgのポリD-リジンを10 mLの水に溶解して1 mg / mlのポリD-リジン溶液を調製し、使用する場合は100倍に希釈してください。.
ファルコン使い捨てペトリ皿、滅菌、コーニング、100x15mm	VWRの	#25373-100
ファルコン使い捨てペトリ皿、滅菌、コーニング、150x15mm	VWRの	#25373-187
HBSS、10X、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし	フィッシャーサイエンティフィック	#14185-052
トリパンブルー	ステムセルテクノロジー	#07050
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ	# 11697498001
qPCRに使用されるプライマー名			qPCRに用いるプライマー配列
MBP-F:			CTATAAATCGGCTCACAAGG
MBP-R:			AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:			ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:			GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
モグF:			GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
モグR:			TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
ガプドF			アトガカカアガアグトグト
ガプド-R			カタッカッガアアトガグクトグ
トゥイ1-F			TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-R			GATGACCTCCCAGAACTTGGCの
PDGFRα-F			AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-R			GTCCCTCCACGGTACTCCT

研究所