転写因子-DNA結合親和性を決定するための蛍光異方性

要約

出典: Jung, C. et al., 蛍光顕微鏡を用いた競争滴定による転写因子-DNA結合親和性の高感度測定。(2019年)。

このビデオでは、転写因子とDNAの相互作用を監視するのに役立つ高性能蛍光異方性について説明しています。このアッセイは、蛍光色素で標識されたDNAの分子回転または異方性による分極の程度を測定することにより、蛍光色素で標識されたDNA分子とその特異的転写因子との相互作用をモニターします。

プロトコル

1. 偏光顕微鏡

1. 広視野レーザー照明の場合は、638 nmの連続ダイオードレーザー(40 mW)のラインをマルチモード光ファイバーの開口部に集束して、ビームクリーンアップを行います。ファイバーの出力に直線偏光子を取り付けて、レーザー光の偏光を設定します。
2. ダイクロイックミラー(640nmカットオフ)とバンドパスフィルター(バンドパス700/75)で、放出された光の励起成分をブロックします。
3. 蛍光信号を偏光ビームスプリッターに通し、放出された光を垂直偏光成分と平行偏光成分に分割します。次に、焦点距離200mmのアクロマティックレンズを用いて、裏面照射型EM-CCDカメラのチップ上に非反射光(平行成分)と反射光(垂直成分)を集光します(図1b、1c)。ミラーを使用して、レンズに向かう垂直ビームの方向を調整します。

2. 蛍光標識参照DNAオリゴマーの設計と試験

1. 参照DNAのコア配列の決定:この方法は、転写因子と、TFへの親和性が参照として機能する蛍光標識DNAとの結合を競合する非標識競合DNAオリゴマーとの間の解離定数(K_D2)を測定する競合アッセイに基づいています。DNaseフットプリントや細菌の1-ハイブリッドなどの他のソースから得られたコンセンサス配列は、出発点として役立ちます.
   手記：経験則として、適切な参照DNAは、コンセンサス配列と比較してTFへの結合親和性が3〜7倍減少します。
2. HiP-FAにより、前のステップで導出されたコンセンサス配列の2-3の暫定的な単一変異のK_D1sを測定します。結合の完全な喪失を避けるために、あまり特異ではないコンセンサス配列の位置を変異させてみてください。
   手記：参照配列が目的の転写因子(このプロトコルGiant Gtで使用)によって結合されていることが重要ですが、強すぎないようにして、より弱い競合他社が高濃度でそれを打ち負かすことができるようにします。
3. コアモチーフ(通常は8〜12塩基対)を16塩基対以上の長さに延長し、両側に対称的に隣接するシーケンスを追加します(適切な結合のためにサイドチェーンを追加します)。必要に応じて(例えば、より長い結合ドメインの場合)、より長い配列を使用します(最大~50塩基対の長さをHiP-FAアッセイで試験しました)
   注意：異所性結合部位を作ることが予想される塩基を追加しないように注意してください。このプロセスを容易にするために、利用可能なPWMから結合部位を予測する計算ツール(PySiteなど)を使用します。
4. 標識された参照DNAとして、3'末端または5'末端の順方向または逆鎖に蛍光標識されたオリゴマーを注文します。例えば、Cy5、Bodipy-650、または任意の他の適切な色素を10μM(100μM10xストック)の濃度で水に使用し、ステップ3.1で説明したように段階的に希釈する。
5. 蒸留水に33 mMリン酸カリウム緩衝液(pH = 7.0)、90 mM NaCl、および0.01%非イオン性界面活性剤を加えて、500 mLの1x結合緩衝液を調製します。また、同じ成分を含む3x結合バッファーを調製しますが、これは3倍の濃度です。1x結合バッファーのストック溶液として3x結合バッファーを使用する場合は、500 mL>容量を調製します。それ以外の場合は、250 mL.
   を調製します。 手記：この組成物は、転写因子の安定性とグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)の二量体化を防ぐために最適化されています。
6. ステップ1で説明した顕微鏡セットアップを使用して、ガラス底顕微鏡96ウェルプレート(TF濃度の異なる5〜6ウェル)に異なる量のTFが存在する中で、0.8 nM標識参照DNAを含む200 μLの結合バッファーのFAを測定し、使用するTF濃度を決定します。TFの量を増やして滴定シリーズを行い、曲線がプラトーに達する濃度をアッセイで選択し、DNA参照オリゴマーの完全な結合を示します
   手記：最適なTF濃度は、TF-DNA解離定数の値によって異なります。一般に、_KDsが低いほど、必要な濃度は低くなります。

3. オリゴマーアニーリング

1. 標識参照DNAのDNAオリゴマー(前のステップで決定した配列)をアニーリングするには、10 mM色素標識フォワード一本鎖DNA溶液7 μLと、その非標識逆補体10 mM濃度7 μLを186 μLの水に混合します。
2. 他社のDNA配列については、フォワード一本鎖DNAの100 mM溶液(メーカー提供の水中)20 μLと、対応する逆一本鎖DNAの100 mMの20 μLを、測定する個々の他社の配列ごとに混合します。
3. 標準的なPCRサイクラーで、溶液を70°Cまで3分間加熱し、温度を0.1 K/sの速度で室温まで下げることにより、アニーリングを別々に行います。使用するPCR装置がその速度での温度勾配をサポートしていない場合は、温度を下げて段階的なインキュベーションを行うだけです(テストは3秒の99サイクル、サイクルあたり-0.4Kでした)。

4. ゲルの調製

>注:次のセクションでは、2つの異なる種類のゲルの調製について説明します:1)滴定ウェルにはタンパク質を含むゲルが含まれており、それぞれの競合するDNA配列_のKDを決定するために使用されます。2)キャリブレーションウェルはNBを使用して、各所与の時点と取得高さでのDNA濃度を決定します。焦点は96ウェルプレートでの実験の準備にありますが、384ウェルプレートフォーマットに対応するボリュームも示されています。

1. 0.5% w/v 低融点アガロースを結合バッファーに溶解し、実験室の電子レンジで煮沸します。完全に溶解した後、ddH₂Oで容量を再度調整して、蒸発の可能性を補います。
   手記：便宜上、ゲルの10 mLアリコートを10〜20個用意し、必要なときに75°Cで溶かします。ゲルストックはRT.
   で保存できます。 注意：電子レンジでゲル溶液を過熱させないように注意してください。間に振とうを挟む短い加熱時間間隔が好ましい。
2. 滴定ウェルおよびキャリブレーションウェルを調製するには、まず2つの10 mLゲルストックアリコートを75°Cで振とうしながら溶解します。
   1. 各競技者に240μL(20%のオーバーヘッドを含む)を使用します(n = 競技者シーケンスの数)。
   2. NBキャリブレーションウェルには同じ量のゲルを使用して、両方のゲルの温度と粘度が等しくなるようにします。
   3. 次に、温度を35°Cに設定し、温度が平衡化するのを待ちます。
3. 滴定ウェルには、1.4 nM(最終濃度)のハイブリダイズ参照DNA(ステップ3で取得)、TFタンパク質(最終濃度CTF = 20-60 nM、ステップ2.6で決定)、DTT(0.2 mM)、および結合バッファーを、総容量n x 200 μLまたはn x 13 μLで96ウェルまたは384ウェルプレートフォーマットで添加します。 それぞれ (およびオーバーヘッド)。反転/振とうして完全に混合します(渦巻きにしないでください)。
4. 96ウェルプレートフォーマット(386ウェルの場合は13μL/ウェル)のゲル溶液をウェルプレートの滴定ウェルにウェルあたり200μLをゆっくりと加えます。
5. キャリブレーションウェルの場合、まず、ウェルの外側で溶融したゲルに5 nM NBを添加します(総容量は使用するウェルプレートのフォーマットとキャリブレーションウェルの数によって異なりますが、通常はウェルプレートあたり5〜6個で十分です)。
6. NB含有ゲル200μL(384ウェルプレートフォーマットの場合は13μL)をウェルプレートの滴定ウェル内でゆっくりとピペットで取り、気泡を避けてください
   手記：電動ピペットやロボットを使用することで、再現性が大幅に向上します。
7. ゲルを室温で10分間固化させ、さらに4°Cで10分間固化させます(必要に応じて、後でガラスから結露を取り除きます)。不均一なゲル表面を避けるために、これらすべてのステップを完全に水平な表面で実行してください。
   手記：タンパク質含有ゲルは、通常、4°Cで少なくとも数時間安定です。

5. 他社のDNA溶液を追加する

>注:以下の溶液は、滴定を開始する前に調製し、キャリブレーションウェルと滴定ウェルの上に同時に追加する必要があります。

1. アニーリングした標識参照DNAおよびタンパク質を、ゲルストックアリコートの3倍の濃度で3倍結合バッファーに添加します。
   1. 得られた溶液20μLを、ステップ3で得られたアニールした各競合DNA溶液40μLと混合します。
   2. 各キャリブレーションウェルについて、15 mM NB溶液を含む20 μLの3x結合バッファーと40 μLのアニールした他社DNA(同じ長さの任意の配列が適切)を混合します
      手記：384ウェルプレートの場合、合計60μLではなく21μLを使用してください。
2. オプションで、マルチウェルプレートリーダーを使用して380 nmの吸光度を測定することにより、プレートのさまざまなウェルのゲル高さレベルの均一性を分光学的に確認します(吸光度値はゲルの高さに比例します)。
3. 混合した他社製DNA溶液(ステップ3でアニーリング)の50 μL(384ウェルプレートフォーマットの場合は7 μL)をゲルの上に加えます。電動マルチチャンネルピペットまたは96チャンネルピペッティングヘッド(利用可能な場合)を使用して、すべての競合他社のソリューションをできるだけ同時に追加してみてください。競合他社のソリューションを追加した後、プレートを顕微鏡ステージに置き、すぐに測定を開始します。

6. 画像取得

1. zスタックの時系列を順次取得します(たとえば、12の平面と100〜300ミリ秒の照明時間を使用します)。ウェル表面に近すぎる(ここで使用するプレートでは<~1.4μm)画像を撮影して、偏光バイアスを排除することは避けてください。
2. TFから標識された参照DNAが完全に解離するまで、10〜25サイクルの測定を行います。エンドポイントは通常、競合他社のDNAの結合速度と拡散性に応じて、1〜2時間後に到達します。

結果

図1:HIP-FAアッセイと実験セットアップの概略図(a)シングルウェル中の競合DNAを滴定するためのゲル送達システム。(b)HIP-FA顕微鏡のセットアップ。EM-CCDカメラで偏光蛍光を検出できるカスタマイズされた全自動広視野顕微鏡。(c)平行(赤)と垂直(緑)の偏光成分を決定するために使用された2つの関心領域を含む生の蛍光画像。(d)96ウェルプレートの典型的なレイアウト。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Cy5標識16/18 bp DNAオリゴマー	ユーロフィン		カスタム合成
16 bp / 18 bp DNAオリゴマー	ユーロフィン		カスタム合成
ナイルブルーA	シグマ	N5632-25Gの
Sensoplate plus マイクロプレート 96 または 384 ウェル、PS	グライナー	655891
384ウェルセンソプレート、ブラック	グライナー	788896
アガロース、低ゲル化温度	シグマ	A9414-50Gの
塩化ナトリウム	メルク	1.06404.1000
Tween-20 (トゥイーン 20	シグマ	P1379-1L
二カリウムリン酸水素三水和物	メルク	1.05099.1000
リン酸二水素カリウム	メルク	1.04873.1000
Q-PODエレメント	メルクミリポア	ZMQSP0DE1
Millipak 40 ガンマゴールドフィルター	メルクミリポア	MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 純水製造システム	メルクミリポア	ZRXQ003WW
クォンタムTIX	メルクミリポア	QTUMOTIX1
DL-ジチオスレイトール	シグマ	43815から1G
マスターサイクラーグラディエント	エッペンドルフ	Z316083
SafeSealチューブ1.5mL	ザルシュテット	72,706,200
チューブ 15 mL	ザルシュテット	62.554.502
Multiply-Proカップ0.2mLPP	ザルシュテット	72.737.002
顕微鏡セットアップ:
全自動広視野顕微鏡	ライカ	DMI6000
長距離対物レンズ	ライカ	HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. ドライ
638nmライン連続ダイオードレーザー	オミクロン	PHOxX 638-40、40mW
裏面照射型EM-CCDカメラ	アンドール	iXon DV897
ダイクロイックミラー	AHFの	640nmカットオフ
バンドパスフィルター	AHFの	ETバンドパス700/75
直線偏光板	ソーラブ	LPVISC050-MP2の
偏光ビームスプリッター	ソーラブ	BS010
アクロマティックレンズ	ソーラブ	焦点距離200mm
マルチモード光ファイバー	オプトロニス	FVP600660710
ロボットシステム:
当社のロボットシステムには、96チャンネルヘッドとサーボシャトルに接続されたSpan-8ピペッターを備えたBiomek NXPワークステーションが含まれており、これらはすべての液体移送ステップに使用されます。さらに、このシステムには、オービタルシェーカーと、Span-8グリッパーが提供するマイクロプレートリーダー(Paradigm、Molecular device)が装備されています	ベックマン・コールター	バイオメックNXP
ソフトウェア：
プログラミング言語	ナショナルインスツル	Labviewの9.0
HiP-FA ソフトウェアのスクリプトは、次の URL から入手できます。			https://github.com/ GeneCenterミュンヘン/HiP-FA

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