標的遺伝子の翻訳制御を研究するためのレポーター遺伝子抑制アッセイ

要約

出典:Katz, N., et al. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、RNA結合タンパク質(RBP)とRNAの相互作用を研究するための細菌のin vivoアッセイを示しています。細菌細胞は、RBP結合部位の下流に蛍光レポーター遺伝子を含むmRNAをコードする結合部位プラスミドの2つのプラスミドコンストラクトで形質転換され、RBPプラスミドは誘導剤の制御下でRBPタンパク質を発現します。誘導剤を介したRBP産生の増加により、RBPはmRNAに結合し、リボソーム結合の阻害を介してレポーターの翻訳抑制を引き起こします。

プロトコル

1. システムの準備

1. 結合部位プラスミドの設計
   1. 結合部位カセットを図 1 に示すように設計します。各ミニ遺伝子には、次の部分(5'から3')が含まれています:Eagl制限部位、カナマイシン(Kan)耐性遺伝子の5'末端の約40塩基、pLac-Araプロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー(δ)、RBP結合部位、mCherry遺伝子の5'末端の80塩基、 およびApaLI制限サイト.
      手記：アッセイの成功率を高めるには、各結合部位に対して3つの結合部位カセットを設計し、少なくとも1つ、2つ、および3つの塩基からなるスペーサーを使用します。その他のガイドラインについては、代表的な結果のセクションを参照してください。
2. 結合部位プラスミドのクローニング
   1. 結合部位カセットを二本鎖DNA(dsDNA)ミニジーンとして注文します。各ミニジーンは長さが約500 bpで、5'末端と3'末端にそれぞれEagl制限部位とApaLI制限部位が含まれています(ステップ1.1.1参照)
      手記：この実験では、陽性コロニーのスクリーニングを容易にするために、カナマイシン遺伝子の半分を持つミニ遺伝子を注文しました。しかし、ギブソンアセンブリもここで適しており、その場合、結合部位は2つの短い相補的一本鎖DNAオリゴとして注文することができる。
   2. 制限プロトコルにより、ミニ遺伝子と標的ベクターの両方をEagl-HFおよびApaLIでダブル消化し、カラム精製します。
   3. 消化されたミニジーンを、残りのmCherryレポーター遺伝子、ターミネーター、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む結合部位骨格にライゲーションします。
   4. ライゲーション溶液を大腸菌TOP10細胞に形質転換します。
   5. サンガーシーケンシングによる正の形質転換体の同定。
      1. 関心領域まで上流の100塩基にプライマーを設計します(プライマー配列については表1を参照ください)。
      2. いくつかの細菌コロニーをMiniprepします。
      3. プライマーの5 mM溶液5 μLとDNA10 μLを80 ng/μLの濃度で調製します。
      4. 2つの溶液をサンガーシーケンシングの便利な施設に送ってください。
   6. 精製したプラスミドは-20°Cで保存し、細菌株はグリセロールストックとして、どちらも96ウェルフォーマットで保存します。その後、DNA は、4 つの融合 RBP プラスミドのうちの 1 つを含む E. coli TOP10 細胞への形質転換に使用されます (ステップ 1.3.5 を参照)。
3. RBPプラスミドの設計と構築
   注:この研究で使用したコートタンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列を表2に示します。
   1. 終止コドンを欠く必要なRBP配列を、末端に制限部位を持つ終止コドンを欠くカスタムオーダーのdsDNAミニジーンとしてご注文ください(図1)。
   2. ステップ1.2.2-1.2.4と同様に、誘導性プロモーターのすぐ下流および開始コドンを欠く蛍光タンパク質の上流に、終止コドンを欠く試験したRBPをクローニングします(図1)。RBPプラスミドに、結合部位プラスミドとは異なる抗生物質耐性遺伝子が含まれていることを確認してください。
   3. ステップ1.2.5と同様に、サンガーシーケンシングにより正の形質転換体を同定します(プライマー配列については表1を参照)。
   4. ポジティブトランスフォーマントを1つ選択し、化学的に有能なものにしてください。-20°Cでグリセロール精製プラスミドとして、-80°Cで細菌株のグリセロールストックとして96ウェルプレートで保存してください。
   5. 96ウェルプレートに保存された結合部位プラスミド(ステップ1.2.6から)を、すでにRBP-mCeruleanプラスミドを含む化学的にコンピテントな細菌細胞に形質転換します。時間を節約するために、細胞をペトリ皿に播種する代わりに、Luria-Bertani(LB)寒天と関連する抗生物質(KanおよびAmp)を含む8レーンプレートに8チャンネルピペッターを使用して細胞を播種します。コロニーは16時間で現れるはずです。
   6. 各ダブル形質転換体に対して1つのコロニーを選択し、関連する抗生物質(KanおよびAmp)を含むLB培地で一晩増殖させ、96ウェルプレートに-80°Cのグリセロールストックとして保存します。

>2. 実験のセットアップ

注:ここで紹介するプロトコルは、インキュベーターおよびプレートリーダーと組み合わせた液体処理ロボットシステムを使用して実行されました。各測定は、24のインデューサー濃度に対して実施され、各株+インデューサーの組み合わせに対して2つの重複がありました。このロボットシステムを使用して、24のインデューサー濃度で1日あたり16株のデータが収集されました。ただし、そのような装置が利用できない場合、または必要な実験が少ない場合は、8チャンネルマルチピペットを使用して手動で簡単に行い、それに応じてプロトコルを適応させることができます。例えば、12のインデューサー濃度と4つの時点を持つ1日あたり4つの株の予備的な結果は、この方法で取得されました。

1. 0.5 gのトリプトン、0.3 mLのグリセロール、5.8 gのNaCl、50 mLの1 M MgSO₄、1 mLの10倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液pH 7.4、および950 mLの二重蒸留水(DDW)を混合することにより、1 Lのバイオアッセイ緩衝液(BA)を事前に調製します。オートクレーブまたは滅菌フィルターでBAバッファーをろ過します。
2. 1.5 mL LBで37 °C、250 rpmの振とうを行い、適切な抗生物質(最終濃度25 μg/mLのカナマイシンと最終濃度100 μg/mLのアンピシリン)を48ウェルプレートで18時間(一晩)かけて増殖させます。
3. 午前中は、以下の準備をしてください。
   1. インデューサープレート。清潔な96ウェルプレートで、95%BAと5%LB26からなるセミプア培地(SPM)を含むウェルをインキュベーターで37°Cで調製します。ウェルの数は、インデューサー濃度の所望の数に対応します。C4-HSLを、インデューサー濃度が最も高い(218 nM)インデューサープレートのウェルに添加します。
   2. ロボットをプログラムして、最高濃度のウェルのそれぞれから培地を0〜218 nMの範囲の23の低濃度に連続希釈します。各インデューサー希釈の量は、すべての菌株(重複菌を含む)に対して十分でなければなりません。
   3. インデューサー希釈液を調製している間に、インキュベーター内の180 μLのSPMを37°Cの96ウェルプレートで温めます。
   4. ステップ2.2からのオーバーナイト菌株を段階希釈で100倍に希釈します:まず、48ウェルプレートで100μLの細菌と900μLのSPMを混合して10倍に希釈し、次に希釈した溶液から20μLを180μLの予熱したSPMにすることで10倍に希釈します。 蛍光測定に適した96ウェルプレート。
   5. インデューサープレートから希釈したインデューサーを、最終濃度に応じて希釈した菌株とともに96ウェルプレートに加えます。
4. 96ウェルプレートを37°Cで6時間振とうしながら、プレートリーダーを介して595 nm(OD595)、mCherry(560 nm/612 nm)、およびmCerulean(460 nm/510 nm)の蛍光を30分ごとに測定します。正規化のために、細胞を追加せずにSMPの増殖を測定します。

結果

図1:システム設計とクローン作成の手順の概要。結合部位プラスミド(左)とRBP-mセルリアンプラスミド(右)のカセット設計の図。次のステップは、両方のプラスミドをコンピテント大腸菌細胞に連続的に形質転換し、最初にRBPプラスミドを使用することです。次に、ダブルトランスフォーダントを、インデューサー濃度の増加におけるmCherry発現レベルについてテストします。RBPが結合部位に結合すると、mCherryのレベルはmCerilean(灰色の泡)の関数として低下します。

表1:結合部位とシーケンシングプライマー。 この研究で使用された結合部位と結合部位カセットの配列、およびプロトコルに詳述されているシーケンシング反応のプライマー (ステップ 1.2.5.1 および 1.3.3)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンピシリンナトリウム塩	シグマ	A9518の
硫酸マグネシウム(MgSO4)	アルファ・アザール	33337
48プレート	アクシゲン	P-5ML-48-C-S
8レーンプレート	アクシゲン	RESMW8I
96ウェルプレート	アクシゲン	P-DW-20-C
プレートリーダー用96ウェルプレート	パーキン・エルマー	6005029
アパリ	NEBの	R0507
結合部位配列	Gen9 Inc.とTwist Bioscience		表 1 を参照してください
大腸菌TOP10細胞	インビトゲン	C404006
イーグル-HF	NEBの	R3505
グリセロール	バイオラボ	71205
孵卵器	テカン	Liconicインキュベーター
ソルフェートカナマイシン	シグマ	K4000
KpnI-HF	NEBの	R0142
リガーゼ	NEBの	B0202Sの
液体処理用ロボットシステム	テカン	EVO 100、MCA 96チャンネル
MATLAB解析ソフトウェア	数学
マルチピペット8レーン	アクシゲン	BR703710
N-ブタノイル-L-ホモセリンラクトン(C 4-HSL)	ケイマン	K40982552 019
PBSバッファ	バイオ産業	020235Aの
プレートリーダー	テカン	インフィニット F200 PRO
Q5 HotStartポリメラーゼ	NEBの	M0493
RBPシーケンス	アドジーン	27121 & 40650	表 2 を参照してください
塩化ナトリウム(NaCl)	バイオラボ	190305
SVゲル&PCRクリーンアップシステム	プロメガ	A9281の
トリプトン	BDの	211705

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