ヘテロメアタンパク質複合体-DNA相互作用を検出するための改変酵母-Oneハイブリッドアッセイ

要約

出典: Tripathi, P. et al., A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、標的DNAと相互作用する複数のタンパク質を検出する改変酵母ワンハイブリッドアッセイを実演します。形質転換酵母細胞は、レポーター遺伝子の上流に標的DNA配列を含んでいます。さらに、転写因子タンパク質を発現します。タンパク質が複合体を形成し、標的DNAに結合すると、レポーター遺伝子が発現し、酵素的に検出することができます。

プロトコル

1. 9日目(午前):酵素測定のための培養を開始します。

1. 分光光度計プレート上のマルチチャンネルピペットを使用して培養物を再懸濁し、125 μLを移します(測定OD₆₀₀).
   手記：注意:OD₆₀₀が0.3〜0.6未満の場合は、気泡を避けるために最後の一滴を分注しないでください、読み取り値に基づいて残りの細胞をさらに1〜2時間インキュベートします。このステップで使用した125 μLの培養物は、ユーザーの裁量で廃棄するか、元のディープウェルブロックに戻すことができます。
2. ディープウェルブロックの残りの細胞を3000 x g、21°Cで10分間遠心分離し、反転させて上清を除去します。
3. 200 μLのZバッファーとボルテックスを加えます.
   手記：表 1 の Z バッファーのレシピを参照してください。
4. 3000 x g、21°Cで5分間遠心分離し、上清を反転させて除去します。
5. 20μLのZバッファーとボルテックスを加えます。
6. 凍結融解サイクルに耐えることができるシーリングホイルでプレートを覆います。ヒュームフードで液体窒素を使用して4サイクルの凍結/融解を行い、次にウォーターバスで42°C(各2分)で凍結/融解します。
7. Zバッファー/β-メルカプトエタノール(β-ME)/オルト-ニトロフェニル-β-ガラクトシド(ONPG)を200 μL加えます(それぞれ12 mL、21 μL、8.4 mgで20 mLの溶液が得られます。常に新鮮な溶液を調製してください)
   手記：ONPGが適切に溶解するまでには時間がかかるため、このステップに到達する1時間前に溶液を準備します。ONPGは、β-ガラクトシダーゼ活性を測定するための基質として機能します。
8. 30°Cで最大17〜24時間インキュベートします(その間に確認し、色が早く発生する場合は次のステップに進みます)。

2. 10日目(午前):反応を止めて測定します。

1. 110 μL 1M Na₂CO₃ を加えて反応を停止し、時間を記録します。
2. ボルテックスし、3000 x g、21°Cで10分間遠心分離します。
3. マルチチャンネルを使用して125μLの上清を採取し、_OD420.
   を測定します 手記： 気泡を避けるために、最後の一滴を分配しないでください。

表 1: プロトコールで使用される溶液のレシピ。この表は、アッセイで使用される主要なバッファーのストック溶液とワーキング溶液のレシピを示しています。

TEバッファー10X(10ml)
願わしい	在庫から
1000mM Tris-Cl (pH 8.0)	トリス1M1mL
10mM EDTA(pH 8.0)	200uL の EDTA 0.5M
水でボリュームを補う
TE/LiAc (10ミリリットル)
願わしい	在庫から
1倍	1mL TE 10倍
0.1M LiAc	1mL LiAc 1M
水でボリュームを補う
TE/LiAc/PEG (50 mL) 50%
願わしい	在庫から
1倍	5 mL TE 10X
0.1M LiAc	5 mL LiAc 1M
40 mL PEG3350
Zバッファー(1L)pH 7.0
Na2HPO4 16.1gの七水和物または8.52gの無水物
NaH2PO4 5.5gの水和物または4gの無水物
KCl 0.75g
MgSO4 0.246gの水和物または0.12gの無水物
HClでpHを維持する
すべての溶液は使用前に厳格化されています。
プロトコルで使用される培地および寒天プレート(YPDA、SD-Ura;SD-Trp-UraおよびSD-Trp-Ura寒天プレート)は、Y1Hと同じレシピに従います

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル丸底プレート	グライナーバイオワン	650101	プラスチック製品
96ディープウェルブロック	USAサイエンティフィック	1896-2000	プラスチック製品
密封可能な箔	USAサイエンティフィック	〒2923-0110	プラスチック製品
アラシール	エクセルサイエンティフィック	B-100	プラスチック製品
2-メルカプトエタノール	フィッシャーサイエンティフィック	034461から100	試験
ONPG	シグマ・アルドリッチ	73660	試験
Na2CO3	シグマ・アルドリッチ	223484	試験
Na2HPO4	シグマ・アルドリッチ	S3264	試験
NaH2PO4	シグマ・アルドリッチ	S3139	試験
KClの	フィッシャーサイエンティフィック	BP366-500	試験
MgSO4	シグマ・アルドリッチ	83266	試験
HCl	フィッシャーサイエンティフィック	SA54-4	試験
ドライバス	サーモフィッシャー		デバイス
渦動	サーモフィッシャー		デバイス
遠心機	エッペンドルフ	遠心分離機 5810R	デバイス
プレートリーダー	分子デバイス	SPECTRAMAX PLUSマイクロプレート分光光度計	デバイス
孵卵器	サーモフィッシャー	モデル番号5250-37度、6250-30度	デバイス
シェーカーインキュベーター	ニューブランズウィック		デバイス
ウォーターバス	サーモフィッシャー	アイソテンプ205	デバイス
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-1	試験

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