ビオチン標識RNA二本鎖を用いた標的タンパク質のヘリカーゼ活性測定

要約

出典:Yu, L. et al., In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、ビオチン標識されたdsRNA基質を巻き戻すための標的タンパク質のヘリカーゼ活性を決定する手順を実演します。この酵素の活性は、電気泳動移動度シフトを解析し、続いて化学発光酵素結合ストレプトアビジンを用いた化学発光アッセイを行うことで同定しました。

プロトコル

1. タンパク質の調製

1. MOV10 式コンストラクト
   1. マウスMOV10をコードするcDNA発現コンストラクトを生成します。
      1. 各フラグメントのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定します。1 μL のマウス cDNA (C57BL/6 マウス精巣由来)、1 μL の dNTP、2 μL の 10 μM フォワードプライマー、2 μL の 10 μM リバースプライマー、1 μL の DNA ポリメラーゼ 1 μL、25 μL の 2x PCR バッファー、および 18 μL の二重蒸留 H₂O (ddH₂O) を最終容量 50 μL で混合します< br /> 手記：Mov10遺伝子断片の増幅のためのプライマーを表1に示します。
      2. 次のプログラムを使用してPCR反応を行います:95°Cで5分間、95°Cで15秒間加熱を35サイクル、64°Cで15秒間アニーリング、72°Cで20秒間の延長(完全長MOV10の延長は2分間)、および68°Cで7分間の延長を行います。
   2. 増幅したPCR DNAをゲル電気泳動で解析し、UVランプの下で必要なサイズのバンドをゲルから素早く切断し、遠心チューブに入れます。
      

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
備品
遠心機	エッペンドルフ(ドイツ)	5242R
化学発光イメージングシステム	Tanon, 中国	5200
デジタルソニファー	Branson, アメリカ	BBV12081048A	450 ワット、50/60 HZ
セミドライ電気泳動ブロッター	Hoefer, アメリカ	TE77XPの
チューブリボルバー	Crystal, アメリカ	3406051
UV光架橋剤	UVP, アメリカ	CL-1000
料
ナイロンメンブレン	Thermo Scientific(米国)	TG263940A
TC処理培養皿	コーニング(米国)	430167	100ミリメートル
TC処理培養皿	コーニング(米国)	430597	150ミリメートル
マイクロチューブチューブ	AXYGEN, アメリカ	MCT-150-Cシリーズ	1.5ミリリットル
チューブ	コーニング(米国)	430791	15ミリリットル
試薬
アンチフラッグM2磁気ビーズ	Sigma, アメリカ	M8823
ATPの	Thermo Scientific(米国)	591136
BCIP/NBTアルカリホスファターゼカラー現像キット	Beyotime, 中国	C3206
CelLyticTM M細胞溶解試薬	Sigma, アメリカ	107M4071V
ClonExpress II ワンステップクローニングキット	Vazyme, 中国	C112
化学発光核酸検出キット	Thermo Scientific(米国)	T1269950
dNTPの	Sigma-Aldrich, アメリカ	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, アメリカ	10569044
EDTAの	Invitrogen, アメリカ	AM9260G	0.5
EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ(アメリカ)	4693132001
EndoFree Maxi プラスミドキット	Vazyme, 中国	DC202
FastPure ゲル DNA 抽出ミニキット	Vazyme, 中国	DC301-01
FBSの	Gibco, アメリカ	10437028
FLAGペプチド	Sigma, アメリカ	F4799
グリセロール	Sigma, アメリカ	SHBK3676
HEPESバッファー	Sigma, アメリカ	SLBZ2837	1メートル
コアアック	サンゴンバイオテック、中国	127〜08〜02
MgCl2	Invitrogen, アメリカ	AM9530G	1メートル
NaCl	Invitrogen, アメリカ	AM9759	5メートル
NP-40	Amresco, アメリカ	M158-500ミリリットル
Opti-MEM媒体	Gibco, アメリカ	31985062
PBSの	Gibco, アメリカ	10010023	pH 7.4
RNase阻害剤	Promega, アメリカ	N251Bの
ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ	Promega, アメリカ	V5591
TBEの	Invitrogen, アメリカ	15581044
Tris-HCIバッファー	Invitrogen, アメリカ	15567027	1 M、pH 7.4
Tris-HCIバッファー	Invitrogen, アメリカ	15568025	1 M、pH 8.0
Tween-20 (トゥイーン 20	サンゴンバイオテック、中国	A600560

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