1. タンパク質の調製
- MOV10 式コンストラクト
- マウスMOV10をコードするcDNA発現コンストラクトを生成します。
- 各フラグメントのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定します。1 μL のマウス cDNA (C57BL/6 マウス精巣由来)、1 μL の dNTP、2 μL の 10 μM フォワードプライマー、2 μL の 10 μM リバースプライマー、1 μL の DNA ポリメラーゼ 1 μL、25 μL の 2x PCR バッファー、および 18 μL の二重蒸留 H2O (ddH2O) を最終容量 50 μL で混合します< br />
手記：Mov10遺伝子断片の増幅のためのプライマーを表1に示します。
- 次のプログラムを使用してPCR反応を行います:95°Cで5分間、95°Cで15秒間加熱を35サイクル、64°Cで15秒間アニーリング、72°Cで20秒間の延長(完全長MOV10の延長は2分間)、および68°Cで7分間の延長を行います。
- 増幅したPCR DNAをゲル電気泳動で解析し、UVランプの下で必要なサイズのバンドをゲルから素早く切断し、遠心チューブに入れます。
手記：MOV10のアガロースゲルに表示される予想製品サイズは3015 bpです。
- PCR DNAをゲル抽出キットで、製造元のプロトコルに従って精製します。
- ステップ1.1.2から同量の溶解バッファーを遠心分離チューブに加え、ゲルを50〜55°Cの水浴で5〜10分間溶解し、ゲル片が完全に溶けるようにします。チューブの壁から液滴を採取するために、短時間遠心分離します。
手記：ゲルおよび溶解バッファーの質量/体積濃度は 1 mg/μL です。
- 吸着カラムをコレクションチューブに入れ、溶解したゲルフラグメントを含む溶液を吸着カラムに移し、12,000 x gで2分間遠心分離します。
- 収集チューブの底にあるろ液を捨てます。600 μL の洗浄バッファーをカラムに加え、12,000 x g で 1 分間遠心分離し、ろ液を廃棄します。
- 手順 1.1.3.3 を 1 回繰り返します。
- カラムをコレクションチューブに戻し、12,000 x g で 2 分間遠心分離して、残りの洗浄バッファーをすべて除去します。
- 1.5 mLの滅菌済み遠心チューブに吸着カラムを置き、吸着カラムの中心に50 μLのddH2Oを加え、12,000 x gで1分間遠心分離します。
- プラスミドの制限酵素消化
- pRK5ベクター4 μg、10倍消化バッファー5 μL、BamHI1 μL、XhoIおよびddH2O1 μLを混合して、最終反応容量50 μLまで混合し、pRK5ベクターをBamHIおよびXhoIで分解します。37°Cで2時間インキュベー
トします。
- ベクターDNAをゲル電気泳動で解析し、UVランプの下のメスでゲルから目的のサイズのバンドをすばやく切断し、遠心チューブに入れます。
- ゲル抽出キットでベクターDNAを1.1.3として精製し、製造元の指示に従ってください。
- 0.03 pmolの直鎖状ベクター、0.06 pmolのcDNAフラグメント、2 μLのリガーゼ、4 μLの5xリガーゼバッファーとddH2Oを最終反応容量10 μLで組み合わせることにより、標準的な組換えライゲーション反応を設定します< / >
手記：MOV10をpRK5ベクターにクローニングします。
- 混合物を37°Cで30分間インキュベートし、その後すぐに氷上で反応を5分間冷却します。MOV10組換えプラスミドをDH5α細菌に変換します.
手記：すべての組換えコンストラクトをサンガーシーケンシングにより検証します。
- 検証済みの組換えプラスミドを含む細菌培養物のグリセロールストックを調製するには、等量の50%グリセロールを液体培養物に添加し、-80°Cで保存します。
手記：その後の各実験では、グリセロールストックから新しい寒天プレートに細菌をストリークアウトし、ステップ1.2で説明したように、単一のコロニーを拡張に使用します。
- HEK293T細胞からのMOV10タンパク質抽出物
- MOV10タンパク質を培養HEK293T細胞で一過性に発現させます。
- MOV10-pRK5プラスミドを>500 ng/μLの濃度で調製します。
- 15cmの皿にHEK293T細胞を播種します。細胞密度が ~70%-90% に達したら、細胞培養培地を 10% のウシ胎児血清 (FBS) と 1% のペニシリン - ストレプトマイシンを含む新鮮なダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) に置き換えます。
- 1回のトランスフェクションで、MOV10-pRK5プラスミドDNA60 μgを還元血清培地3 mLで希釈し、トランスフェクションエンハンサー試薬120 μLを加えてよく混合します。
- 別のチューブで、トランスフェクション試薬90 μLを3 mLの還元血清培地(ペニシリン-ストレプトマイシンなし)で希釈し、よく混合します。
- 希釈したDNAを希釈したトランスフェクション試薬の各チューブに加えます。室温で15分間インキュベートします。
- トランスフェクション混合物を細胞培養物に加え、細胞を~36~48時間培養します。
- 36〜48時間後、50mLチューブで各プレートから細胞を採取します。500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、各ペレットを10 mLの氷冷PBSで洗浄し、500 x gで4°Cで5分間遠心分離して細胞を回収します。
- ペレットを、完全なエチレンジアミン四酢酸(EDTA)フリープロテアーゼ阻害剤カクテルを含む3 mLの細胞溶解バッファーに再懸濁します。氷上で30分間インキュベートします。ライセートを20,000 x g、4°Cで20分間遠心分離します。
- 1.5 mLチューブに細胞ディッシュあたり100 μLの抗FLAG磁気ビーズを添加します。
- 磁気ビーズをK150バッファー(pH 7.5の50 mM HEPES、150 mM KoAc、1 mM DTT、0.1% NP-40)で2回洗浄します。
- 磁気ビーズを氷冷したK150バッファー1mLに再懸濁します。
- 磁気ビーズを4°Cで2分間、穏やかに回転させてインキュベートし、磁石を使用して磁気ビーズをペレット化します。上清を取り除き、廃棄します。
- ステップ1.3.3の細胞溶解物上清に磁気ビーズを加え、4°Cで2時間インキュベー
トします。
- タンパク質結合磁気ビーズをK150バッファーで3回、次に250 mM NaClを含むK150で2回、次にK150バッファーで3回1.3.5として洗浄します。
- ビーズを300 μLのFLAG溶出バッファー(100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM MgCl2、10%グリセロール)に再懸濁し、FLAGペプチドを最終濃度0.5 μg/μLまで添加し、ローテーター上でビーズと4°Cで1時間インキュベートした後、磁石を使用して磁気ビーズをペレット
化します。
- 溶出したMOV10タンパク質を含む上清を採取し、濃度を決定し、将来の使用のために-80°Cで保存します。
2. 核酸調製
- DNAおよびRNAオリゴヌクレオチド(オリゴ)は、ビオチン標識の有無にかかわらず、適切な供給元から購入してください。各オリゴをRNaseフリーのddH2Oで20 μMに希釈し、将来の使用に備えて-80°Cに保ちます。
手記：この研究で使用したDNA/RNA基質のオリゴ配列を表2に示します。
- MOV10ヘリカーゼ活性アッセイのための二本鎖RNA(dsRNA)アニーリング反応のために、以下の混合物を調製します:pH 7.5、6 mM KCl、0.2 mM MgCl2、およびRNase-free ddH2Oで60 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタン-スルホン酸(HEPES)を最終反応容量20 μLで混合します。
- ビオチン標識トップ鎖(2 μM、最終濃度)と1.5倍非標識相補ボトム鎖の混合物をアニーリングバッファー中で95°Cで5分間加熱(ステップ2.2)し、その後室温(RT)までゆっくりと冷却することにより、RNAオリゴをアニーリングしてRNA二本鎖を形成します。
3. in vitro生化学的アッセイ
- EMSAと酵素反応
- MOV10ヘリカーゼ活性アッセイでは、pH 7.5、20 mM KoAc、2 mM MgCl2、0.01% NP-40、1 mM DTT、2 U/μL RNase阻害剤、10 nMビオチン標識RNA基質、2 mMアデノシン三リン酸(ATP)、100 nM RNAトラップ、および20 ngのMOV10タンパク質とddH2Oを最終反応容量20 μLで混合します。反応混合物を37°Cで10分間インキュベートします。 30分、60分反応を停止するために5倍ストップバッファーを追加します.
手記：RNAトラップは、配列を持つビオチン非標識オリゴで、標識オリゴに相補性があり、巻き戻されたdsRNAが再びアニーリングするのを防ぎます。
- ポリアクリルアミドゲル
- ゲルプレート(16 cm x 16 cm)と1.5 mmコームを洗浄します。ゲル電気泳動ユニットを組み立てます。
- 10%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、14 mLのddH2O、1.25 mLの10x Tris-boric acid-EDTA(TBE)、8.3 mLの30%アクリルアミド、1.25 mLの50%グリセロール、187.5 μLの10%の新たに調製した過硫酸アンモニウム(APS)、および12.5 μLのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を混合します。
- 20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、5.5 mLのddH2O、1.25 mLの10x TBE、1.25 mLの50%グリセロール、16.7 mLの30%アクリルアミド、187.5 μLの10% APS、および12.5 μLのTEMEDを混合します。
- アクリルアミド溶液をすぐにゲルに注ぎ、コームを挿入します。混合物を約30分間重合させます。
- ゲルランニング
- コームを取り外し、電気泳動ランニングバッファー(0.5x TBE)をタンクに充填します。
- サンプルウェルを0.5x TBEバッファーですすぎ、ゲルを氷上で100 Vで30分間事前に実行し、ランニングバッファーを新しい0.5x TBEと交換します。
- 20〜25μLのサンプルを各ウェルにロードします。
- EMSAアッセイには10%天然アクリルアミドゲルを、酵素アッセイには20%天然アクリルアミドゲルを使用してください。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの底部に移動するまで、氷浴上で100 Vで電気泳動を実行します。
- ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用のレーンを取り外してゲルをトリミングします。ゲルを0.5x TBEバッファーに入れます。
- 濾紙とナイロンメンブレンをゲルの大きさにカットします。きれいな濾紙とナイロンメンブレンを事前に濡らします。
- 転送用のスタックを組み立てます。
- プレウェットメンブレンをプレウェットフィルターペーパーの上に置きます。
- ゲルをメンブレンに置きます。
- ゲルを事前に濡らした濾紙の別の層で覆います。
- 清潔なピペットを中央から端まで転がして、すべての気泡を取り除きます。
- サンプルをゲルからメンブレンに半乾式電気泳動装置で90mAで20分間移します。
- 転写を停止し、新しい濾紙でメンブレンを1分間乾燥させます。
- 254 nmの球根を備えたUV光架橋剤に120 mJ/cm2の膜を45-60秒間照射することにより、試料を架橋します(自動架橋機能)。メンブレンをRTで30分間風乾します。
- 化学発光検出
- プロトコル1:標準容量の市販の化学発光核酸検出キットを使用します。
- 20 mLのブロッキングバッファーをメンブレンに加え、20〜25 rpmでローテーター上で穏やかに振とうしながら15〜30分間インキュベー
トします。
- 20 mLのブロッキングバッファーに66.7 μLの安定化ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加して、コンジュゲート/ブロッキングバッファー溶液を調製します。
- ブロッキングバッファーを静かに取り外し、コンジュゲート/ブロッキングバッファーと交換します。ローテーター上で20-25rpmで15分間インキュベートします。
- メンブレンを40〜45rpmで5分間振とうしながら4回洗浄します。
- 30 mLの基質平衡化バッファーをメンブレンに加えます。20〜25rpmで振とうしながら、メンブレンを5分間インキュベートします。
- 6 mLの安定過酸化物溶液に6 mLのルミノール/エンハンサー溶液を加えて、基質ワーキング溶液を調製します。光を避けてください。
- メンブレンの全面を基質ワーキング溶液で覆い、5分間インキュベートします。
- 化学発光イメージングシステムでメンブレンを1〜3秒間スキャンします。
表1:MeiobおよびMov10の遺伝子断片をPCR増幅するために使用したプライマー。フォワードプライマーとリバースプライマーの太字はBamHIおよびNotIカッティングサイトです。リバースプライマーの斜体の太字はXhoIカッティングサイトです。ボックス内の太字は、点突然変異R235Aに対応するヌクレオチドを示しています。
| フラグメント | プライマー | シーケンス(5'から3'まで) |
| MEIOB-A | フォワード | CGGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC |
| 逆 | AT GCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG |
| MEIOB-C | フォワード | CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA |
| 逆 | CGATGCGGCCGCCTCTTTTTTTTTCTTATATATAATTCAGTAG |
| MEIOB-E | フォワード | CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACTGCC |
| 逆 | CGATGCGGCCGCタクトタグCTGTTCCACTG |
| MEIOB-E-mut | フォワード | CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC |
| 逆 | GTTAAAATTTATTGCカカチャガ |
| MOV10 | フォワード | GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC |
| 逆 | GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG |
表2:この研究で使用したDNA/RNA基質の配列。
| フィギュア用 | 名 | シーケンス (5' から 3') |
| 図 2、5 | 36 nt ssDNA | 5'-ビオチン-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (DNA) |
| 図 3 | 36 nt ssRNA | 5'-ビオチン-グググ |
| 図 4 | 54 nt 5'テールdsRNA | 5'-ビオチン-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA)
5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA) |
