免疫蛍光法によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

要約

出典:de la Peña Avalos, B., et al., Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (2020).

この動画では、照射した細胞核の二本鎖DNA切断部位におけるDNA修復タンパク質γH2AXと53BP1の局在を可視化する免疫蛍光法について解説します。

プロトコル

1. 核抽出と細胞固定

1. 原液を調製する:0.2 M PIPES(pH 6.8)、5 M NaCl、2 Mスクロース、1 M MgCl₂、0.1 M EGTA(pH 8.0)。
2. 核抽出バッファー(NEB)を調製する:10 mM PIPES(pH 6.8)、100 mM NaCl、300 mMスクロース、3 mM MgCl₂、1 mM EGTA(pH 8.0)、および0.5%(v / v)Triton X-100をddH₂Oに溶解します。
3. 4%(v / v)パラホルムアルデヒド(PFA)を調製する:10 mLの16%PFA水溶液を30 mLのPBSに溶解します。完全に溶解するまで混ぜます。
4. 適切な時点(t = 0、1、2、4、16時間)で、1 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。PBSを完全に取り外します。
5. 細胞核抽出のために各ウェルに 200 μL の NEB を添加します (細胞質は分解され、核のみが残ります) (図 1)。室温で 2 分間インキュベートし、完全に除去します。
   手記：2分を超えないようにしてください。
6. 細胞を1mLのPBSで洗浄します。PBSを完全に取り外します。PBSを慎重に追加すると、このステップで細胞は非常に壊れやすいです。
細胞
7. 固定のために、各ウェルに200 μLの4%(v/v)PFAを添加します。4°Cで10分間インキュベートし、PFAを完全に除去します。
8. PBS.
   1 mL を加えます。 手記：細胞は4°CのPBSに保存することができます。

2. 免疫蛍光染色

1. ブロッキング溶液を調製する:PBSに5%BSA(w / v)を溶解し、0.3%(v / v)Triton X-100を添加します。完全に溶解するまで混合します。
2. 希釈バッファーを調製する:1% BSA(w/v)をPBSに溶解し、0.3%(v/v)Triton X-100を添加します。完全に溶解するまで混合します。
3. ブロッキングには、各ウェルに200 μLのブロッキング溶液を加えます。室温で2時間、または4°Cで16-18時間インキュベートします
   手記： ヤギ抗体を使用する場合は、ブロッキング溶液に5%ヤギ血清を加えます。
4. 一次抗体を希釈バッファー(1:500;抗体リストについては表1を参照)で希釈し、十分に混合されるまでボルテックスします
   手記：ヤギ抗体を使用する場合は、希釈バッファーに1%ヤギ血清を添加してください。
5. 湿度/インキュベーションボックスに、パラフィルムを接着します。一次抗体10 μLを(1滴中)加えます。カバースリップの一方の端を液滴に合わせ、ゆっくりとパラフィルムに下ろして、液体が全体に広がるようにします(可能であれば気泡を避けてください)。室温で2時間インキュベートします。
6. カバースリップをPBSで1分間3回洗います。
7. 二次抗体を希釈バッファー(最終濃度:2 μg/mL)で希釈し、よく混ざるまでボルテックスで希釈します。
8. 一次抗体について説明したように、10 μLの二次抗体を塗布します。室温で2時間インキュベートします.
   手記：光から保護してください。

>表1:使用した抗体。この研究で使用された抗体のリスト。

名

抗体	会社	参考	源
53BP1	細胞シグナル伝達	4937	兎
抗マウスIgG H&L(Alexa Fluor 647)	アブカム	ab150103	驢馬
抗リン酸化ヒストンH2A。X(Ser139)、クローンJBW301	ミリポア	05-636	鼠
抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor 488)	アブカム	AB150081	山羊

9. カバースリップをPBSで1分間3回洗います。
10. カバースリップをH₂Oで1分間洗浄します。
11. DAPIによるDNAの対比染色:10 μLの300 nM DAPI(抗体についての説明)を適用し、室温で30分間インキュベートした後、グリセロールベースの封入剤を用いてスライドガラスにマウントします。または、DAPIを含む市販の退色防止封入剤をスライド上に1滴(10 μL)加え、カバースリップを塗布します。カバーガラスをそっと押し、ペーパータオルでカバーガラスの周りの余分な液体を取り除きます。
12. カバースリップを透明なマニキュアで密封し、20分間乾燥させます。
13. スライドは4°Cで保管してください。

3. 画像取得

1. 60倍対物レンズに液浸油を一滴垂らします。DAPIを使用して、接眼レンズを通して原子核を見つけます。
   1. XYZ画像取得の場合は、取得ソフトウェアを開き、パラメータを選択します: スキャナータイプ:ガルバノ;スキャナーモード:ラウンドトリップ;画像サイズ:512×512;PMTモード:VBF;PMT平均:フレーム(4回);PMTシーケンシャルスキャン:ライン。
   2. 色素と検出器を選択します:
      チャンネル(CH1)、色素(DAPI)、検出器(SD1)
      チャンネル(CH2)、色素(Alexa Fluor 488)、検出器(HSD3)
      チャンネル(CH3)、色素(Alexa Fluor 647)、検出器(HSD4)
   3. 「Z」でONを選択します。
2. ライブ画像を調整します。ライブウィンドウのライブボタンを押します。
   1. フォーカスを調整し、「PMT」ツールウィンドウでレーザー強度(%)、感度(HV)、ゲイン、オフセットを設定します。
      1. レーザー強度(%)を調整します:明るさと漂白のために。レーザー強度が高いほど信号は強くなりますが、試料は光退色します。
      2. 感度(HV):ノイズレベルを調整します。HVが高いほど信号は強くなりますが、高すぎると画像にノイズが入ります.
         注意: 常に電圧を一定に保ちます。
      3. オフセットを調整します:背景レベル。
   2. Z スタックの場合は、[開始/終了 (15 スライス)] を選択します。
3. 取得を開始します。
   1. 画像を保存するフォルダを選択します。LSM の [スタート] ボタンを押して、イメージの取得を開始します。Series Doneボタンを押して、画像取得を完了します。

結果

図 1.核抽出。

核抽出前(左)と抽出後(右)の細胞の代表的な画像。細胞質は消化されるべきですが、核構造は抽出後も無傷のままであるべきです（右〉。(A)20倍の倍率。スケールバー= 20μmおよび(B)40倍の倍率。スケールバー = 10 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カバーグラス#1、丸型18mm(カバースリップ)	ニュービトロ	NC0308920	カバーガラスは、使用する前にHClまたはエタノールで洗浄および滅菌する必要があります。
DPBS、カルシウム、マグネシウム不使用	ギブコ	14190144	組織培養用PBS
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI(SlowFade ダイヤモンド アンチフェード マウンタント)	インビトゲン	S36973	代わりに、VECTASHIELD退色防止封入剤を備えた300 nM DAPIを使用することができます。
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A3059の	降水量/背景を避けるために、ヒートショックフラクションをお勧めします。
トリトンX-100	アメリカンバイオ	AB02025	核抽出バッファー。
Superfrost Plus 顕微鏡スライド	フィッシャーブランド	1255015	ポリサインスライドを代わりに使用できます。