アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

要約

出典:Kresoja-Rakic, J., et al.デスチオビオチン-ストレプトアビジン-アフィニティーを介した中皮腫細胞におけるRNA相互作用タンパク質の精製。 J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、mRNAのアデニル酸ウリジル酸リッチエレメント(ARE)配列と相互作用するRNA結合タンパク質(RBP)を同定するためのin vitro RNAプルダウンアッセイを実演しています。細胞ライセートからの標的RBPをRNAプローブと混合して、RNA-タンパク質複合体を形成します。複合体は、RNAプローブのデスチオビオチン標識のストレプトアビジン標識磁気ビーズへの親和性を利用した親和性精製により単離されます。

プロトコル

1. 細胞質および核タンパク質画分の調製

1. 10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)、および 2 mM L-グルタミン (200 mM) を添加した RPMI - 1640 培地で増殖した T150 細胞培養フラスコ中の 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 細胞をプレートします。細胞が80-90%(~5-5.5 x 10⁶細胞)のコンフルエンスに達したら、核画分と細胞質画分のタンパク質抽出を進めます
   手記：ACC-MESO-4細胞株は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手しました。
2. 培地を吸引し、1x PBSを15 mL加えて細胞を洗浄し、プレートを数回静かに傾け、1x PBSを吸引します。0.25% Trypsin-EDTAを3 mL加え、培養フラスコを37°Cで3分間インキュベートします
   手記：顕微鏡で細胞の剥離を確認します。まだ取り付けられている場合は、フラスコを手のひらに3回軽くたたいます。
3. 10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)、および 2 mM L-Glutamine (200 mM) を添加した RPMI-1640 培地 7 mL を添加し、細胞を 15 mL チューブに集め、200 x g で 5 分間スピンダウンします。
4. 培地を吸引し、細胞ペレットを1.5 mLの1x PBSで再懸濁し、細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。500 x g、4°Cで5分間スピンダウンします。上清を捨てます.
   手記：このステップ以降、すべての遠心分離ステップを4°Cで実行し、すべての試薬を氷上に保ちます。
5. 氷冷した1.5 mLの1x PBSで細胞ペレットを再懸濁し、細胞を500 x g、4°Cで3分間スピンダウンします。上清を捨てます
   手記：CER I、CER II、およびNER試薬の必要量は、それぞれ推定細胞ペレット充填量の10、0.55、および5容量です。次のプロトコルは、20μLの容量を想定しています。試薬CER Iは必要な量だけ調製することをお勧めします。
6. 200 μLの氷冷細胞質抽出試薬(CER I)に2 μLの1xプロテイナーゼ阻害剤を添加します(例:プロテアーゼ阻害剤(EDTAフリー)1錠を500 μLの水で希釈すると、ストック量が100倍になります。この量の試薬CER Iは、細胞ペレット充填量20 μLを溶解するのに十分です。
   1. 細胞ペレットの充填量を推定するには、細胞ペレットを含むチューブと、1x PBSの10、20、50、または100 μLで満たされた1.5 mLチューブを比較します。
7. チューブを激しくボルテックスして細胞ペレットを15秒間再懸濁し、チューブを氷上で10分間インキュベートし、氷冷した細胞質抽出試薬II(CER II)を11 μLをチューブに加え、5秒間激しくボルテックスし、氷上で1分間インキュベー
トします。
8. 5秒間激しくボルテックスし、チューブを16,000 x g、4°Cで5分間遠心分離します。上清を氷上のきれいな予冷チューブに移します。上清は、RNAプルダウン実験でさらに使用される細胞質画分です。
9. 残りのペレットを100 μLの氷冷核抽出試薬(NER)に再懸濁し、1 μLのプロテイナーゼ阻害剤(100x)を補充し、15秒間激しくボルテックスします。プロテアーゼ阻害剤を添加したNER試薬は、必要な量だけ調製することをお勧めします。
10. サンプルを氷上で40分間インキュベートし、時折15秒間(10分ごと)ボルテックスします。
11. チューブを16,000 x gで10分間遠心分離し、上清(これが核タンパク質画分)を清潔な予冷チューブに移します。
12. すぐにビシンコニン(BCA)法を使用してタンパク質濃度を測定します(材料の表を参照)。各画分のタンパク質純度を制御するには、α-チューブリン(細胞質画分のみの陽性検出)およびPoly ADP-リボースポリメラーゼ-PARP(核画分のみの陽性検出)に対して免疫ブロッティング(図1)を行います。
13. タンパク質の活性とその天然状態を維持するために、細胞質抽出物および核抽出物のアリコート25μLを調製します。これらのアリコートを液体窒素に5秒間入れて急速冷凍し、-80°Cで直接保存します。

2. デスチオビオチンによるRNAの標識

1. RNAプローブを商業的に合成し、HPLCを精製します。ヌクレアーゼフリー水で10 μM.
   再懸濁してください。 手記：プローブ配列を表1に示します。
2. RNAプルダウン反応ごとに50 pmolのRNAを使用してください。PEG 30%を除くすべての試薬を解凍し、氷上に保ちます。これは、RNAオリゴの3'末端の標識に使用されます。
3. CALB2 3' UTR (ARE)、CALB2 3' UTR (mtARE)、および無関係 RNA (IRE) と標識された 5 μL の 10 μM RNA プローブを 0.5 mL の薄肉微量遠心チューブに移し、PCR マシンで 85 °C で 5 分間インキュベートします。チューブをすぐに氷上に置きます。
   手記：このステップは、標識のためのRNAプローブの緩和とアクセス性を促進するため、重要です。
4. 30 μL の反応を 1 回行うには、3 μL のヌクレアーゼフリー水、3 μL の 10x RNA Ligase Reaction Buffer 3 μL、1 μL の RNase Inhibitor (40 U/μL)、1 μL のデスチオビオチン化シチジンビスリン酸 (1 mM)、2 μL の T4 RNA リガーゼ (20 U/μL) の 10 μL 混合物を RNA 含有チューブに加えます
   手記：3つのサンプルが過剰(3.2)のマスターミックスAを調製するには、9.6 μLのヌクレアーゼフリー水、9.6 μLの10x RNA Ligase Reaction Buffer、3.2 μLのRNase Inhibitor(40 U/μL)、3.2 μLのDesthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate(1 mM)、および6.4 μLのT4 RNAリガーゼ(20 U/μL)を混合します。
5. 15 μLのPEG 30%を反応液に慎重に加えます。別のチップを使用して反応を混ぜます。反応液を16°Cで一晩インキュベートします。
6. 翌日、5 M NaCl(フレッシュ/ヌクレアーゼフリー)、クロロホルム:イソアミルアルコールを24:1の比率で調製します(例:1反応あたり-96 μLのクロロホルムと4 μLのイソアミルアルコール)、氷冷100%エタノール、および氷冷70%エタノール。
7. 70 μLのヌクレアーゼフリー水をRNA標識反応チューブに加えます。100 μLのクロロホルム(イソアミルアルコール)を加え、短時間ボルテックスします。13,000 x gで3分間スピンダウン。上相のみを慎重に取り外し、新しいヌクレアーゼフリーの1.5mLチューブに移します。下のフェーズには触れないでください。
8. 5 M NaCl 10 μL 、グリコーゲン 1 μL 、氷冷 100% エタノール 300 μL を添加します。チューブを-20°Cで2時間置きます
   手記： このステップでは、実験を翌日に続けることができます。
9. 13,000 x g、4°Cで15分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を慎重に廃棄します。氷冷した70%エタノール300μLを加え、再度13,000 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
10. 上清を完全に捨て、ペレットを風乾します(15分)。ペレットを20μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します
    手記：同日にRNAプルダウンを進めてください。
11. RNAを90°Cで2分間インキュベートし、氷上に置きます。ストレプトアビジン磁気ビーズの予備洗浄の次のステップで、標識されたRNAを氷上に置きます
    手記：インキュベーション時間が長くなると、RNAプローブが損傷する可能性があります。

3. RNA-タンパク質プルダウン

1. ストレプトアビジン磁気ビーズの予備洗浄とデスチオビオチン-RNAによるインキュベーション
   1. 50 pmol RNAあたり50 μLのストレプトアビジン磁気ビーズを使用してください。ただし、これは実験に応じて最適化する必要があります。
   2. ストレプトアビジン磁気ビーズでチューブを15秒間ボルテックスし、カットしたピペットチップを使用して、200 μL(マスターミックス、3+1反応に十分)を清潔な1.5 mLのセーフロックチューブにすばやく取り出します。チューブを磁気スタンドに置き、ビーズがチューブの側面に集まるようにして1分間待ちます。再懸濁液を取り除きます。
   3. ビーズを洗浄するには、チューブをマグネットスタンドから取り外し、0.1 M NaOH溶液400 μLと0.05 M NaCl溶液を加え、数回静かにピペッティングします。チューブを磁気スタンドに戻します。1分待ってから上清を回収します。この手順をもう一度繰り返します。
   4. ビーズを200 μLの100 mM NaClで洗浄します。上清を取り除きます。
   5. 200 μLの20 mM Tris(pH 7.5)を添加し、ピペッティングでビーズを再懸濁し、チューブを磁気スタンドに置き、1分間待ってから上清を取り除きます。この手順を繰り返します。
   6. チューブをマグネティックスタンドから取り外し、200 μLの1x RNA Captureバッファーを加え、短時間ボルテックスしてストレプトアビジンマグネティックビーズを再懸濁します。50 μLのストレプトアビジン磁気ビーズを取り出し、カットしたピペットチップを使用して各標識RNAチューブに加えます。チューブをローラー上で室温で30分間インキュベートします。
2. タンパク質のRNAへの結合
   1. チューブを磁気スタンドに入れ、1分間待ってから、上清を取り除きます。
   2. 20 mM Tris(pH 7.5)を50 μLをビーズに加え、ピペッティングで再懸濁してください。チューブを磁気スタンドに入れ、1分間待ってから、上清を取り除きます。この手順を繰り返します。
   3. 100 μLの1x Protein-RNA結合バッファーをビーズに加え、ピペッティングで再懸濁してください。
   4. それまでの間、10 μL の 10x Protein-RNA 結合バッファー、30 μL の 50% グリセロール、50 μg の細胞質タンパク質、および 100 μL までのヌクレアーゼフリー水 100 μL の混合物を準備します
      手記：33 μL の 10x Protein-RNA 結合バッファー、99 μL の 50% グリセロール、165 μg の細胞質タンパク質、および 330 μL までのヌクレアーゼフリー水 3.3 サンプルの超過分については、マスターミックス B を調製します。マスターミックス B のチューブを氷上に保管します。
   5. チューブを磁気スタンドに入れ、1分間待ってから、上清を回収します。マスターミックスBを100μL加え、ピペッティングで静かに上下させて再懸濁し、気泡が発生しないようにします。反応チューブをローラー上で4°Cで60分間インキュベートします。
3. 洗浄と溶出
   1. チューブを磁気スタンドに入れ、上清(フロースルー-FT)を収集し、新しいチューブに移します
      手記：この FT は、後で分析するために氷上に置いておきます。
   2. 1x Washバッファー100μLをビーズ上にピペットで移し、穏やかに再懸濁し、磁気スタンドに戻し、1分間待ってから上清を捨てます。この手順を 2 回繰り返します。
   3. 40 μLのElution Bufferを磁気ビーズに加え、ピペッティングで上下に混合し、チューブシェーカー(950 rpm)で37°Cで30分間インキュベートします。
   4. チューブをマグネットスタンドに入れ、1分間待ってから、溶出したサンプル(溶出液-E)を回収します。氷の上に置いて下流の分析に使用.
      手記：このステップでは、試験した各 RNA プローブは、フロースルー (FT) サンプルと溶出液 (E) サンプルで構成されます。

結果

図1:5 μgの細胞質および核タンパク質画分のウェスタンブロット解析。 PARPタンパク質は核画分(N)に存在しますが、細胞質(C)画分には存在しません。α-チューブリンは細胞質画分(C)に存在しますが、核分画(N)には存在しません。

表1:RNAプローブの配列

RNAプローブ	順序	濃度
CALB2 3' UTR (ARE...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NE-PER核および細胞質抽出キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78833
Pierceプロテアーゼ阻害剤錠剤、EDTAフリー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A32965の
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23225
Pierce Magnetic RNA-protein プルダウンキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20164	磁気ビーズが含まれているため、キットは4°Cで保管する必要があります
Pierce RNA 3' 末端デスチオビオチン化キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20163	このキットは「Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit」の一部であり、プルダウンキット(4°C)とは異なり、-20°Cで保存する必要があります。
DynaMag-2、マグネットスタンド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12321Dさん
RPMI - 1640 中程度	シグマ・アルドリッチ	R8758
FBS - 濾過ウシ血清	パンバイオテクノロジー	品番40-37500
ペニシリン - ストレプトマイシン (100x)	シグマ・アルドリッチ	P4333
L-グルタミン溶液(200 mM)	シグマ・アルドリッチ	G7513
0.25% トリプシン-EDTA (1x)	Gibco by Life テクノロジーズ	〒25200-056
RNaseZap RNase除染ソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM9780
RNAオリゴ合成	Mycrosynth AG、スイス	-	合成スケール - 0.04 μmol - HPLC精製
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A7030
塩酸(HCl)6 M	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	182883.1211
超高純度 1 M トリス、pH 7.5	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15567027
グリセロール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17904	50%滅菌アリコートは-20°Cで保存します
ピアスストレプトアビジン磁気ビーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88817	これらの磁気ビーズの平均直径は1μm(0.5〜1.5μmの範囲)であることに注意してください。さらに、ホモジネートサイズ2.8μmのビーズであるDynabeads-M280ストレプトアビジンもRNAプルダウンに使用されますが、これは精製プロセスに影響を与える可能性があることに注意してください。
硫酸アルミニウム-(14-18)-水和物	シグマ・アルドリッチ	368458
オルトリン酸	アプリケム	A0637 (英語