アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

要約

出典:Kresoja-Rakic, J., et al.デスチオビオチン-ストレプトアビジン-アフィニティーを介した中皮腫細胞におけるRNA相互作用タンパク質の精製。 J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、mRNAのアデニル酸ウリジル酸リッチエレメント(ARE)配列と相互作用するRNA結合タンパク質(RBP)を同定するためのin vitro RNAプルダウンアッセイを実演しています。細胞ライセートからの標的RBPをRNAプローブと混合して、RNA-タンパク質複合体を形成します。複合体は、RNAプローブのデスチオビオチン標識のストレプトアビジン標識磁気ビーズへの親和性を利用した親和性精製により単離されます。

プロトコル

1. 細胞質および核タンパク質画分の調製

1. 10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)、および 2 mM L-グルタミン (200 mM) を添加した RPMI - 1640 培地で増殖した T150 細胞培養フラスコ中の 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 細胞をプレートします。細胞が80-90%(~5-5.5 x 10⁶細胞)のコンフルエンスに達したら、核画分と細胞質画分のタンパク質抽出を進めます
   手記：ACC-MESO-4細胞株は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手しました。
2. 培地を吸引し、1x PBSを15 mL加えて細胞を洗浄し、プレートを数回静かに傾け、1x PBSを吸引します。0.25% Trypsin-EDTAを3 mL加え、培養フラスコを37°Cで3分間インキュベートします
   手記：顕微鏡で細胞の剥離を確認します。まだ取り付けられている場合は、フラスコを手のひらに3回軽くたたいます。
3. 10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)、および 2 mM L-Glutamine (200 mM) を添加した RPMI-1640 培地 7 mL を添加し、細胞を 15 mL チューブに集め、200 x g で 5 分間ス....

結果

図1:5 μgの細胞質および核タンパク質画分のウェスタンブロット解析。 PARPタンパク質は核画分(N)に存在しますが、細胞質(C)画分には存在しません。α-チューブリンは細胞質画分(C)に存在しますが、核分画(N)には存在しません。

表1:RNAプローブの配列

RNAプローブ	順序	濃度
CALB2 3' UTR (ARE.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NE-PER核および細胞質抽出キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78833
Pierceプロテアーゼ阻害剤錠剤、EDTAフリー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A32965の
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23225
Pierce Magnetic RNA-protein プルダウンキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20164	磁気ビーズが含まれているため、キットは4°Cで保管する必要があります
Pierce RNA 3' 末端デスチオビオチン化キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20163	このキットは「Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit」の一部であり、プルダウンキット(4°C)とは異なり、-20°Cで保存する必要があります。
DynaMag-2、マグネットスタンド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12321Dさん
RPMI - 1640 中程度	シグマ・アルドリッチ	R8758
FBS - 濾過ウシ血清	パンバイオテクノロジー	品番40-37500
ペニシリン - ストレプトマイシン (100x)	シグマ・アルドリッチ	P4333
L-グルタミン溶液(200 mM)	シグマ・アルドリッチ	G7513
0.25% トリプシン-EDTA (1x)	Gibco by Life テクノロジーズ	〒25200-056
RNaseZap RNase除染ソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM9780
RNAオリゴ合成	Mycrosynth AG、スイス	-	合成スケール - 0.04 μmol - HPLC精製
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A7030
塩酸(HCl)6 M	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	182883.1211
超高純度 1 M トリス、pH 7.5	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15567027
グリセロール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17904	50%滅菌アリコートは-20°Cで保存します
ピアスストレプトアビジン磁気ビーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88817	これらの磁気ビーズの平均直径は1μm(0.5〜1.5μmの範囲)であることに注意してください。さらに、ホモジネートサイズ2.8μmのビーズであるDynabeads-M280ストレプトアビジンもRNAプルダウンに使用されますが、これは精製プロセスに影響を与える可能性があることに注意してください。
硫酸アルミニウム-(14-18)-水和物	シグマ・アルドリッチ	368458
オルトリン酸	アプリケム	A0637 (英語

年度 年度 の の ) )