アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

1. 細胞質および核タンパク質画分の調製

1. 10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)、および 2 mM L-グルタミン (200 mM) を添加した RPMI - 1640 培地で増殖した T150 細胞培養フラスコ中の 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 細胞をプレートします。細胞が80-90%(~5-5.5 x 10⁶細胞)のコンフルエンスに達したら、核画分と細胞質画分のタンパク質抽出を進めます
   手記：ACC-MESO-4細胞株は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手しました。
2. 培地を吸引し、1x PBSを15 mL加えて細胞を洗浄し、プレートを数回静かに傾け、1x PBSを吸引します。0.25% Trypsin-EDTAを3 mL加え、培養フラスコを37°Cで3分間インキュベートします
   手記：顕微鏡で細胞の剥離を確認します。まだ取り付けられている場合は、フラスコを手のひらに3回軽くたたいます。
3. 10% FBS、1x ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)、および 2 mM L-Glutamine (200 mM) を添加した RPMI-1640 培地 7 mL を添加し、細胞を 15 mL チューブに集め、200 x g で 5 分間スピンダウンします。
4. 培地を吸引し、細胞ペレットを1.5 mLの1x PBSで再懸濁し、細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。500 x g、4°Cで5分間スピンダウンします。上清を捨てます.
   手記：このステップ以降、すべての遠心分離ステップを4°Cで実行し、すべての試薬を氷上に保ちます。
5. 氷冷した1.5 mLの1x PBSで細胞ペレットを再懸濁し、細胞を500 x g、4°Cで3分間スピンダウンします。上清を捨てます
   手記：CER I、CER II、およびNER試薬の必要量は、それぞれ推定細胞ペレット充填量の10、0.55、および5容量です。次のプロトコルは、20μLの容量を想定しています。試薬CER Iは必要な量だけ調製することをお勧めします。
6. 200 μLの氷冷細胞質抽出試薬(CER I)に2 μLの1xプロテイナーゼ阻害剤を添加します(例:プロテアーゼ阻害剤(EDTAフリー)1錠を500 μLの水で希釈すると、ストック量が100倍になります。この量の試薬CER Iは、細胞ペレット充填量20 μLを溶解するのに十分です。
   1. 細胞ペレットの充填量を推定するには、細胞ペレットを含むチューブと、1x PBSの10、20、50、または100 μLで満たされた1.5 mLチューブを比較します。
7. チューブを激しくボルテックスして細胞ペレットを15秒間再懸濁し、チューブを氷上で10分間インキュベートし、氷冷した細胞質抽出試薬II(CER II)を11 μLをチューブに加え、5秒間激しくボルテックスし、氷上で1分間インキュベー
トします。
8. 5秒間激しくボルテックスし、チューブを16,000 x g、4°Cで5分間遠心分離します。上清を氷上のきれいな予冷チューブに移します。上清は、RNAプルダウン実験でさらに使用される細胞質画分です。
9. 残りのペレットを100 μLの氷冷核抽出試薬(NER)に再懸濁し、1 μLのプロテイナーゼ阻害剤(100x)を補充し、15秒間激しくボルテックスします。プロテアーゼ阻害剤を添加したNER試薬は、必要な量だけ調製することをお勧めします。
10. サンプルを氷上で40分間インキュベートし、時折15秒間(10分ごと)ボルテックスします。
11. チューブを16,000 x gで10分間遠心分離し、上清(これが核タンパク質画分)を清潔な予冷チューブに移します。
12. すぐにビシンコニン(BCA)法を使用してタンパク質濃度を測定します(材料の表を参照)。各画分のタンパク質純度を制御するには、α-チューブリン(細胞質画分のみの陽性検出)およびPoly ADP-リボースポリメラーゼ-PARP(核画分のみの陽性検出)に対して免疫ブロッティング(図1)を行います。
13. タンパク質の活性とその天然状態を維持するために、細胞質抽出物および核抽出物のアリコート25μLを調製します。これらのアリコートを液体窒素に5秒間入れて急速冷凍し、-80°Cで直接保存します。

2. デスチオビオチンによるRNAの標識

1. RNAプローブを商業的に合成し、HPLCを精製します。ヌクレアーゼフリー水で10 μM.
   再懸濁してください。 手記：プローブ配列を表1に示します。
2. RNAプルダウン反応ごとに50 pmolのRNAを使用してください。PEG 30%を除くすべての試薬を解凍し、氷上に保ちます。これは、RNAオリゴの3'末端の標識に使用されます。
3. CALB2 3' UTR (ARE)、CALB2 3' UTR (mtARE)、および無関係 RNA (IRE) と標識された 5 μL の 10 μM RNA プローブを 0.5 mL の薄肉微量遠心チューブに移し、PCR マシンで 85 °C で 5 分間インキュベートします。チューブをすぐに氷上に置きます。
   手記：このステップは、標識のためのRNAプローブの緩和とアクセス性を促進するため、重要です。
4. 30 μL の反応を 1 回行うには、3 μL のヌクレアーゼフリー水、3 μL の 10x RNA Ligase Reaction Buffer 3 μL、1 μL の RNase Inhibitor (40 U/μL)、1 μL のデスチオビオチン化シチジンビスリン酸 (1 mM)、2 μL の T4 RNA リガーゼ (20 U/μL) の 10 μL 混合物を RNA 含有チューブに加えます
   手記：3つのサンプルが過剰(3.2)のマスターミックスAを調製するには、9.6 μLのヌクレアーゼフリー水、9.6 μLの10x RNA Ligase Reaction Buffer、3.2 μLのRNase Inhibitor(40 U/μL)、3.2 μLのDesthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate(1 mM)、および6.4 μLのT4 RNAリガーゼ(20 U/μL)を混合します。
5. 15 μLのPEG 30%を反応液に慎重に加えます。別のチップを使用して反応を混ぜます。反応液を16°Cで一晩インキュベートします。
6. 翌日、5 M NaCl(フレッシュ/ヌクレアーゼフリー)、クロロホルム:イソアミルアルコールを24:1の比率で調製します(例:1反応あたり-96 μLのクロロホルムと4 μLのイソアミルアルコール)、氷冷100%エタノール、および氷冷70%エタノール。
7. 70 μLのヌクレアーゼフリー水をRNA標識反応チューブに加えます。100 μLのクロロホルム(イソアミルアルコール)を加え、短時間ボルテックスします。13,000 x gで3分間スピンダウン。上相のみを慎重に取り外し、新しいヌクレアーゼフリーの1.5mLチューブに移します。下のフェーズには触れないでください。
8. 5 M NaCl 10 μL 、グリコーゲン 1 μL 、氷冷 100% エタノール 300 μL を添加します。チューブを-20°Cで2時間置きます
   手記： このステップでは、実験を翌日に続けることができます。
9. 13,000 x g、4°Cで15分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を慎重に廃棄します。氷冷した70%エタノール300μLを加え、再度13,000 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
10. 上清を完全に捨て、ペレットを風乾します(15分)。ペレットを20μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します
    手記：同日にRNAプルダウンを進めてください。
11. RNAを90°Cで2分間インキュベートし、氷上に置きます。ストレプトアビジン磁気ビーズの予備洗浄の次のステップで、標識されたRNAを氷上に置きます
    手記：インキュベーション時間が長くなると、RNAプローブが損傷する可能性があります。

3. RNA-タンパク質プルダウン

1. ストレプトアビジン磁気ビーズの予備洗浄とデスチオビオチン-RNAによるインキュベーション
   1. 50 pmol RNAあたり50 μLのストレプトアビジン磁気ビーズを使用してください。ただし、これは実験に応じて最適化する必要があります。
   2. ストレプトアビジン磁気ビーズでチューブを15秒間ボルテックスし、カットしたピペットチップを使用して、200 μL(マスターミックス、3+1反応に十分)を清潔な1.5 mLのセーフロックチューブにすばやく取り出します。チューブを磁気スタンドに置き、ビーズがチューブの側面に集まるようにして1分間待ちます。再懸濁液を取り除きます。
   3. ビーズを洗浄するには、チューブをマグネットスタンドから取り外し、0.1 M NaOH溶液400 μLと0.05 M NaCl溶液を加え、数回静かにピペッティングします。チューブを磁気スタンドに戻します。1分待ってから上清を回収します。この手順をもう一度繰り返します。
   4. ビーズを200 μLの100 mM NaClで洗浄します。上清を取り除きます。
   5. 200 μLの20 mM Tris(pH 7.5)を添加し、ピペッティングでビーズを再懸濁し、チューブを磁気スタンドに置き、1分間待ってから上清を取り除きます。この手順を繰り返します。
   6. チューブをマグネティックスタンドから取り外し、200 μLの1x RNA Captureバッファーを加え、短時間ボルテックスしてストレプトアビジンマグネティックビーズを再懸濁します。50 μLのストレプトアビジン磁気ビーズを取り出し、カットしたピペットチップを使用して各標識RNAチューブに加えます。チューブをローラー上で室温で30分間インキュベートします。
2. タンパク質のRNAへの結合
   1. チューブを磁気スタンドに入れ、1分間待ってから、上清を取り除きます。
   2. 20 mM Tris(pH 7.5)を50 μLをビーズに加え、ピペッティングで再懸濁してください。チューブを磁気スタンドに入れ、1分間待ってから、上清を取り除きます。この手順を繰り返します。
   3. 100 μLの1x Protein-RNA結合バッファーをビーズに加え、ピペッティングで再懸濁してください。
   4. それまでの間、10 μL の 10x Protein-RNA 結合バッファー、30 μL の 50% グリセロール、50 μg の細胞質タンパク質、および 100 μL までのヌクレアーゼフリー水 100 μL の混合物を準備します
      手記：33 μL の 10x Protein-RNA 結合バッファー、99 μL の 50% グリセロール、165 μg の細胞質タンパク質、および 330 μL までのヌクレアーゼフリー水 3.3 サンプルの超過分については、マスターミックス B を調製します。マスターミックス B のチューブを氷上に保管します。
   5. チューブを磁気スタンドに入れ、1分間待ってから、上清を回収します。マスターミックスBを100μL加え、ピペッティングで静かに上下させて再懸濁し、気泡が発生しないようにします。反応チューブをローラー上で4°Cで60分間インキュベートします。
3. 洗浄と溶出
   1. チューブを磁気スタンドに入れ、上清(フロースルー-FT)を収集し、新しいチューブに移します
      手記：この FT は、後で分析するために氷上に置いておきます。
   2. 1x Washバッファー100μLをビーズ上にピペットで移し、穏やかに再懸濁し、磁気スタンドに戻し、1分間待ってから上清を捨てます。この手順を 2 回繰り返します。
   3. 40 μLのElution Bufferを磁気ビーズに加え、ピペッティングで上下に混合し、チューブシェーカー(950 rpm)で37°Cで30分間インキュベートします。
   4. チューブをマグネットスタンドに入れ、1分間待ってから、溶出したサンプル(溶出液-E)を回収します。氷の上に置いて下流の分析に使用.
      手記：このステップでは、試験した各 RNA プローブは、フロースルー (FT) サンプルと溶出液 (E) サンプルで構成されます。

図1:5 μgの細胞質および核タンパク質画分のウェスタンブロット解析。 PARPタンパク質は核画分(N)に存在しますが、細胞質(C)画分には存在しません。α-チューブリンは細胞質画分(C)に存在しますが、核分画(N)には存在しません。

表1:RNAプローブの配列