RNA-タンパク質相互作用を同定するためのSELEXベースのIn Vitro結合アッセイ

1. タンパク質結合反応と結合RNAの分離

1. 10 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 μLの容量でタンパク質とRNAの結合を行い、これらの最終濃度に次の成分を添加します:50 mM KCl、1 mM DTT、0.09 μg/μL ウシ血清アルブミン、0.5 units/μL RNasin、0.15 μg/μL tRNA、1 mM EDTA、 30 μLの適切な組換えタンパク質(PTB)濃度。適切なプールからRNAを追加してください.
   手記： スプライシング因子U2AF65は、通常、約1〜10 nMの結合親和性(平衡解離定数またはKD)でモデルイントロンのポリピリミジントラクト/3'スプライス部位に結合します。したがって、結合の最初の2ラウンドでは、U2AF65のKDの10倍上のタンパク質濃度を使用しました。SXLおよびPTBタンパク質の場合、この範囲の開始濃度は私たちの最善の推測にすぎませんでした。これにより、目的のRNA種が結合できることが保証されましたが、親和性の低い配列も結合する可能性があります。ラウンド3と4(転写、結合、増幅)では、タンパク質濃度が3倍に減少しました。これは、低親和性RNA種を成功裏に排除するために行われました。
2. 結合反応を含むチューブを25°Cで約30分間、温度ブロック(または氷上)に置きます。
3. 以下のステップを使用して、選択増幅の最初の4ラウンドについて、結合していないRNAから結合RNAを分画します。
   1. サンプル(100 μL)を真空マニホールドに取り付けられたニトロセルロースフィルターで室温でろ過します
      手記：RNA-タンパク質複合体はフィルター上に残りますが、結合していないRNAは残っていません。
   2. RNAが保持されているフィルターを滅菌済みのカミソリの刃で断片に切り刻み、これらを遠心分離チューブに挿入します。プロテイナーゼK(PK)バッファーに浸漬したフィルターピースで、チューブを最低3時間(または一晩)静かにタンブリングしてRNAを回収します。
   3. RNAサンプルを等量のフェノール-クロロホルム(1:1)の存在下でボルテックスし、次にクロロホルムの存在下でボルテックスすることにより、RNAサンプルを除タンパクします。毎回、サンプルを室温で5分間高速で遠心分離することにより、水相を回収します。
   4. 酢酸ナトリウム(0.1容量の3.0 M、pH 5.2)およびエタノール(2〜3容量の無水エタノール、200プルーフ)と混合します。チューブを-80°Cの冷凍庫に30分間放置し、高速で10分間遠心分離し、洗浄および乾燥手順に従って、DEPCで処理した水にRNAを可溶化します。
4. タンパク質結合型RNAフラクションを、最後の2ラウンド(ラウンド5および6、転写、結合、増幅)の非結合フラクションから分離します。結合反応(ステップ1.1)のタンパク質濃度をさらに3倍に減らして選択圧力を追加し、高親和性結合配列を濃縮し、低親和性配列を優先的に除去します。
   1. 上記のRNA:タンパク質結合(ステップ1.1)反応を設定する前に、0.5x TBEバッファー(Tris-Borate-EDTA)で天然ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド比60:1で5%)をプレキャストします。このゲルを冷蔵室(4°C)で250Vを15分間印加して電気泳動します。
   2. 上記のRNA:タンパク質結合反応(ステップ1.1)をこのゲルの異なるウェルにピペットで移します
      手記：タンパク質を-80°Cで保存し、使用前に20 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)、pH 8.0、20%グリセロール、0.2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.05%NP-40、および1 mMジチオスレイトール(DTT)で希釈します。0.5〜1.0 mMプロテアーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)の添加は任意です。結合反応では、この緩衝液は約6%のグリセロールに寄与するため、サンプルを別のゲルローディング緩衝液と混合することなく、サンプルをウェルに直接ロードできます。
   3. 未結合のRNAから結合したRNAをゲル電気泳動を用いて、低温室(4°C)で250Vで1〜2時間分画します。このプロセスは、ゲル移動度シフトアッセイとしても知られています.
      注:電気泳動の持続時間は、結合に使用されるRNAおよびタンパク質の特徴によって異なります。
   4. ゲルをX線フィルムに露光し、オートラジオグラフィーを使用して結合したRNAの位置を特定します。結合したRNAでゲルスライスを切り取り、チューブに挿入します。
   5. 溶出に使用したPKバッファーで、砕いたゲルスライスを3時間または一晩インキュベートします。
   6. 溶出したRNAサンプルを最初にフェノール-クロロホルムで、次にクロロホルムで激しくボルテックスします。
   7. クロロホルム抽出後の水相と酢酸ナトリウムとエタノールを混合します。-80°Cのフリーザーでインキュベートした後、4°Cで5〜10分間遠心してRNAペレットを回収します。RNAペレットをエタノールで洗浄し、チューブの蓋を開けたままにして風乾します。DEPC.
      で処理した水にRNAを溶解します。 手記：分画のためにゲル移動度シフトアッセイに切り替えると、例えば、分画のための最初のラウンドで使用されるニトロセルロースフィルター(または任意のマトリックス)への結合のために濃縮された可能性のある不要なRNA種を排除できます。

2. 逆転写とPCR増幅

1. 20 μL反応液(2 μL 10x RT Buffer、2 μL AMV reverse transcriptase、1 μM reverse primer、10 μL of RNA、RNase inhibitor optional)をインキュベートし、逆転写酵素と逆プライマーを使用して溶解したRNAからcDNAを合成します。これは、42 °Cで60分間です。
2. 20〜25回のPCRサイクルを使用してcDNAを増幅します。1 μM DNAランダムライブラリテンプレート、各プライマー1 μM、20 mM Tris(pH 8.0)、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl、0.1 μg/μLアセチル化ウシ血清アルブミン、2ユニットのTaqポリメラーゼ、および各200 μMのdNTP(デオキシグアノシン、 デオキシアデノシン、デオキシシチジン、およびデオキシチミジン三リン酸)。

3. 転写とタンパク質結合

1. RNA合成、タンパク質結合、およびタンパク質結合画分と非結合画分との分離のプロセスを繰り返します。