溶液中のタンパク質-脂質相互作用を研究するためのマイクロスケール熱泳動

要約

出典:Sparks, R. P. et al., タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用。J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオは、タンパク質-脂質相互作用を研究するためのマイクロスケールの熱泳動を示しています。このアッセイは、温度勾配に応答した蛍光標識タンパク質の熱泳動運動を定量化することにより、分子間の相互作用を検出します。蛍光分子は、異なる濃度の非蛍光脂質分子と混合され、溶液中の分子の混合物は毛細血管にロードされます。キャピラリー内のサンプルに温度勾配を適用し、温度勾配内の蛍光分子の動きを検出して記録します。

プロトコル

1. 材料の準備

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します:137 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM NaH₂PO₄、および2 mM KH₂PO_4、pH 7.4。
2. NTA-Atto 647 N染料を調製します。ストックNTA-Atto 647 N色素を100% DMSO溶液から100 nMに希釈し、TweenなしでPBSに希釈します。
3. Vam7-His8 – タンパク質を大腸菌の融合タンパク質として発現させ、Ni-NTAおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製します。
4. PBSバッファーで分析物を滴定します。分析種が異なるバッファー中にある場合、分析種バッファーの内容物が標識タンパク質と相互作用しない限り、標識されたMSTはDMSOなどの分子とのわずかなバッファーの違いに対して特に感受性がありません。

2. MSTデバイスの準備

1. デバイスの背面にある電源スイッチをオンにします。
2. 制御ソフトウェアを開き、デバイスに接続されているコンピューターでラップトップの電源が入っていて、接続状態になっていることを確認します。
3. この実験の蛍光設定とMST設定を入力します。MST Beforeを3秒、MSTを30秒、蛍光回収率(Fluo.)を設定します。1秒後。ビフォアは初期蛍光を測定し、長い時間を必要としません。MSTは、熱誘導後に平衡に達する実際の時間です。
4. キャピラリーの表:各キャピラリーチューブについて、ターゲット(リガンド)の名前、リガンド(分析物)の名前、ターゲットの濃度、および最高滴定濃度を入力し、オートフィル滴定比を使用します。例えば、ターゲット濃度にVam7-His8、ターゲット名にVam7-His8、リガンド名に(1,2-ジオクタノイルホスファチジン酸)Di-C8 PA、リガンドの最高濃度に1:1を選択し、スロット2-16までドラッグダウンします。
5. Cap Scanを実行して、ターゲットタンパク質のシグナルに基づいて適切なLED(20% LED(プリセット))を選択し、標識されたMSTの蛍光単位を200〜2000の間で調整します。
6. MSTパワーの範囲を選択し、それぞれに値を入力して最も堅牢なバインディングフィットをテストし、Start Cap Scan + Measurementを押して、さまざまな値をスキャンして、テスト対象の特定のインタラクションに最適な動作条件を決定します。
7. 解析ソフトウェアとTjumpによる熱泳動のプリセットを使用して、最適なMSTパワーを決定します。最も低い濃度と最も高い濃度の間のほとんどの蛍光分離に従って、最適な MST パワーと比較してフィットを解析し、反復試験の MST パワーを選択します。
8. 1回目と2回目の間に光退色が発生したかどうかは、解析ソフトウェアに移動し、解析をエキスパートモードに切り替えて確認します。次に、熱泳動ではなく蛍光を選択して分析します。エキスパートモードを選択し、次に光退色を選択します。

>3. 標識MST用サンプルの調製

1. Vam7-His8溶液をTweenなしでPBS中の濃度200 nMにします。
2. NTA-Atto 647 色素を Tween なしで PBS 中で 100 nM にします。
3. Vam7-His8 と NTA-Atto 647 色素を 1:1 の容量比で混合し、室温で 30 分間光で覆って放置します。セクション 2.5 のように、標的タンパク質の適切な濃度を決定します (ビデオで示されている Ni-NTA 色素の KD の利用に関する補足を参照)。
4. NTA-Atto 647 N色素とタンパク質の混合物を、卓上遠心分離機を使用して暗室で約8,161 x gで10分間遠心分離します。
5. 実験後は4°Cで保存するか、実験中は氷上で保存し、タンパク質の変性を防ぐために必要に応じて数時間以内に再利用してください。
6. NT濃度ファインダーを使用して、滴定に必要な濃度範囲を決定します。
7. Di-C8 PAを水中の適切な最大濃度にします。
8. 前のステップに基づいて、PBSバッファーで1:1の段階希釈を使用して、16濃度で分析種を滴定します。SPRとは異なり、熱泳動はバッファーの違いにそれほど敏感ではありません。

>4. サンプルの MST

1. デバイスと接続されているラップトップの電源を入れます。
2. 機械の前面にある上矢印を押して、キャピラリーラックを引き出します。
3. キャピラリーをラックにロードし、位置 1 に最も高い濃度でキャピラリーをロードします。
4. 制御ソフトウェアで、NTA-Atto 647Nに対応する赤チャンネルを選択します。
5. 各キャピラリーの濃度、位置、および名前の情報をキャピラリーのテーブルに入力します。
6. 20% LED(プリセット)でStart Cap Scanを押してキャピラリースキャンを実行し、LED強度設定またはリガンド(標識タンパク質)の濃度を使用して、200〜2000の蛍光単位の間でそれに応じて調整します。
7. MST 電力の範囲を選択します。
8. Cap Scan + MST測定を開始します。
9. 解析ソフトウェアを使用して解析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Cy5 マレイミドモノ反応性色素	GEヘルスケア	PA23031	タンパク質の標識用
GraphPadプリズム	GraphPadソフトウェア
モノリスNT.115キャピラリー(1000カウント)	ナノテンパー	モ-K022	MST用キャピラリー
モノリスNT.115マシン	ナノテンパー		大学の設備
NTA-ATTO 647 N	シグマ	2175	彼のタグのラベル
ホスファチジルイノシトール 3-リン酸 diC8 (PI(3)P diC8)	部隊	P-3008	結合実験用脂質

名