標識タンパク質-リン脂質小胞相互作用を研究するための定量的フローサイトメトリー

要約

出典: Podoplelova, N. et al., Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、定量的フローサイトメトリーを使用して、タンパク質と人工リン脂質小胞との相互作用を示しています。蛍光標識タンパク質が蛍光標識リン脂質小胞に結合すると、平均蛍光強度が増加し、この増加はフローサイトメーターによって検出されます。

プロトコル

>1. フローサイトメトリーによるタンパク質-脂質相互作用の検出

1. キネティック結合実験
   1. Tyrodeの緩衝液(20 mM HEPES、150 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、0.4 mM NaH₂PO₄、2.5 mM CaCl₂、5 mMグルコース、0.5%BSA、pH 7.4)中のリン脂質小胞を、濃度1 μM、総容量250 μLに希釈します。
   2. ステップ1の蛍光標識凝固因子X(fX-fd)を500 nMの濃度で、ステップ1.1.1のリン脂質小胞と1:1の比率(最終小胞濃度0.5 μM、fX-fd濃度はfXの250 nM)を総容量500 μLに混合します。
   3. 500 μL の混合懸濁液 (低流速での分析では ~20 分) を直ちにフローサイトメーターに注入します。低流量を使用し、チャネルFL2(励起488 nm、蛍光フィルター585/42 nm)のしきい値が値200であることを確認します。蛍光色素のチャネルFL4(励起633 nm、蛍光フィルター660/20)の平均蛍光をTable of Materials.
      から測定します。 手記： オートサンプラーのないサイトメーターを選択してください。これにより、サンプルを測定セルに注入するプロセスがスピードアップします。
   4. 結合の飽和が達成されたら(5分以内に蛍光の有意な増加が見られない)、サンプルをTyrodeバッファーで20倍に急速に希釈し、ベースライン蛍光に達するまで(完全な解離)、またはプラトーに達するまで(5分以内に蛍光の有意な減少がない)解離をモニターします
      手記：コントロールとして、10 μM EDTAを添加し、完全な解離を5分間モニターします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 647 NHSエステル(スクシンイミジルエステル)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A37573 (英語)	蛍光染料
BDファクスカントII	BDバイオサイエンス
DiIC16(3) (1,1'-ジヘキサデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D384	蛍光染料
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D8418
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H4034-500Gのご紹介
L-α-ホスファチジルセリン(脳、ブタ)(ナトリウム塩)	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	840032P
L-α-ホスファチジルコリン(脳、ブタ)	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	840053P
ミニ押出機	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	610020から1EA
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P9541-500G
塩化カルシウム、無水、粉末、≥97%	シグマ・アルドリッチ	C4901-100G
リン酸ナトリウム一塩基性	シグマ・アルドリッチ	S3139-250G
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S3014-500G
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M8266-100G
ウシ血清アルブミン	VWRライフサイエンスAMRESCO	AM-O332-0.1
EDTA二ナトリウム塩	VWRライフサイエンスAMRESCO	AM-O105B-0.1