タンパク質-脂質二重層相互作用を研究するための散逸性微小重量測定技術

要約

出典:Matos, A. L. L., et al. Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、タンパク質の脂質二重層への結合を調査するための散逸性微重量測定技術を示しています。マイクロバランスのクォーツセンサーの表面をコーティングするために、小さな単層小胞が追加されます。標的リン脂質結合タンパク質のカルシウムイオン依存性結合を利用して、センサーの発振周波数の変化と発振の散逸を監視し、タンパク質-脂質二重層結合の性質を決定します。

プロトコル

>注:バッファーは0.22μmフィルターを使用してろ過し、真空で1時間脱気する必要があります。

1. 脂質ベシクルの調製

1. 2mLのガラス管を使用してください。各脂質、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(POPS)、およびコレステロール(Chol)をクロロホルム/メタノールの混合物(50:50 v/v)に溶解して、透明な5 mM脂質溶液を調製します。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-ミオ-イノシトール-4',5'-ビスリン酸)(PI(4,5)P₂)をクロロホルム/メタノール/水(20:9:1 v / v)の混合物に溶解します。
2. 溶解した脂質を、POPC/POPS (80/20)、POPC/PI(4,5)P2 (95/5)、POPC/POPS/Chol (60/20/20)、POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20)、POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) の所望のモル比で 10 mL ガラス管に組み合わせます<br /> 手記：総脂質の最終量は500μgです。
3. 窒素の乾燥流を使用して有機溶媒を蒸発させます。脂質混合物を高真空(凍結乾燥)システムに3時間放置して、溶媒の残留微量を除去します.
   手記：これにより、乾燥した透明なフィルムが得られます。
4. 脂質フィルムを1 mLのクエン酸緩衝液(10 mMクエン酸三ナトリウム、150 mM NaCl、pH 4.6)に再懸濁します。脂質懸濁液を60°C(この温度は、混合物中の最も高い融解脂質の相転移温度より約10°C高い)で水浴中で30分間インキュベートし、5分ごとに激しくボルテックスします
   手記：これにより、大きなマルチラメラ小胞(MLV)が形成されます。懸濁液を転移温度より上に保ちます。
5. 直径50 nmの細孔径ポリカーボネートメンブレンを装備した押出機(この場合は60°C)を、転移温度(ここでは40〜50°C)より高く30分間予熱します。
6. MLV懸濁液を予熱した押出機にロードし、混合物をポリカーボネート膜に31回穏やかに通して、小さなユニラメラベシクル(SUV)を形成します。温度を遷移温度より高く保ちます。
7. SUV懸濁液を2mLのプラスチック反応容器に移し、クエン酸緩衝液(ステップ1.4を参照)を加えて、最終容量を2mLにします><。 手記：これにより、最終的な脂質濃度は 250 μg/mL になります。

2. 水晶センサーの取り扱い

>注:クォーツセンサーは常にピンセットで取り扱ってください。

1. ポリテトラフルオロエチレンホルダーに挿入した4つのセンサーを2%SDS溶液中で≥30分間インキュベートし、超純水で広範囲に洗浄してSDSを完全に除去し、乾燥アルゴンまたは窒素の流れを使用して乾燥させます。
2. プラズマ洗浄システムを使用して、汚染物質を完全に除去します。ドライセンサーをプラズマ洗浄チャンバーに挿入し、チャンバーを排気し、酸素で3倍に洗い流します。プラズマクリーナーの電源を入れます。次のプロセスパラメータを使用します:1 x ^10-4 Torr圧力、高無線周波数(RF)電力、および10分のプロセス時間。機械の電源を切り、センサーを取り出します。

3. マイクロバランスの操作

>注:4つの温度制御フローチャンバーを並列構成にし、ペリスタルティックポンプに接続し、流量を80μL / minに設定したマイクロバランスシステムを使用しました。オープンフローモードでは、バッファーはフィーダーリザーバーから受入タンクにポンプで送られました。ループモードでは、受入タンクをフィーダーリザーバーに接続して閉ループを生成しました。温度は20°Cに設定しました。

1. プラズマ洗浄されたセンサーをピンセットを使用して、4つのフローチャンバーに慎重にドッキングします。漏れの原因となる可能性のあるチャンバーやチューブへの圧力やねじれを避けてください。
2. クエン酸バッファー(10 mM クエン酸三ナトリウム、150 mM NaCl、pH 4.6)でシステムをオープンフローモードで 10 分間
   でフラッシュします。 手記：これにはちょうど3.2 mLのバッファーが必要ですが、余分なバッファー(10 mL)を使用することをお勧めします。
3. プログラムを起動します。ソフトウェアを使用して、周波数と散逸のベースラインが安定するまで、ソフトウェアを使用して最初の基本音(n = 1st)と倍音(n = 3rd-13th)の周波数と散逸の変更の記録を開始します(これには約40〜60分かかります)
   手記： 周波数ノイズレベル(ピークツーピーク)は0.5Hz未満で、散逸については0.1・10-6未満で、最大ドリフト(水溶液中)は周波数で1 Hz / h、散逸で0.3・10-6 / hである必要があります。
4. ベースラインが安定したら、SUV懸濁液をクエン酸緩衝液(小さなチューブに2 mL)で塗布します。反応容器を使用して、デッドボリュームの1.5mLを除去します。次に、ループフローモードでシステムを閉じます。周波数/散逸シフトをさらに10分間記録します。
   手記：この間、小胞はSiO₂表面に広がり、融合して連続した二重層を形成します(図1、図2、図3のステップ2)。センサーの表面へのSUVの吸着は2相であり、散逸の周波数の最小値と最大値が一般的です。26 〜 29 Hz(表1を参照)からの特性周波数シフト(脂質組成による)を伴う安定した新しい周波数/散逸ベースラインは、表面上に連続した二重層を示しています。
5. SLB が安定している場合(ステップ 3.4 を参照)、ランニングバッファー(10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4)を使用して、必要な Ca²⁺ 濃度(実験に応じて 50 μM から 1 mM CaCl₂ の範囲)のオープンフローモードで 40 分間システムを平衡化します。
6. タンパク質(ここではAnxA2)をCa²⁺を含むランニングバッファーに添加します(ステップ3.5を参照)。平衡定常状態に達するまで、ループフローモードでタンパク質の適用を実行します(図1、図2、および図3のステップ3)
   手記：タンパク質濃度は1〜400nMの範囲であり得る。タンパク質の吸着は、質量(タンパク質)の吸着を反映した濃度依存的な周波数シフトを引き起こします。
7. オープンフローモードで、ランニングバッファー中の Ca2+ イオンを 5 mM EGTA でキレート化することにより、結合タンパク質を解離します (図 1 および図 2 のステップ 4).
   手記：SLBベースラインへの周波数と散逸の回復は、タンパク質結合の完全な可逆性を示しています。会合解離サイクルを繰り返すことで、異なる濃度やタンパク質を比較することができます。

結果

表1:SLBの脂質組成と形成データ

組成	SLB形成後のΔΔF/Hz	SLB形成後のΔΔD*10-6
ポップス/ポップス(80 : 20)	26.3 ± 0.2	0.26 ± 0.03
POPC/PI(4,5)P2(95 : 5)	26.5 ± 0.5	0.31 ± 0.02
POPC/POPS/チョル(60 : 20 : 20)	29.2 ± 0.2

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
化学薬品
塩化カルシウム	メルク	017-013-00-2	99パーセント
クロロホルム	ロス	4432.1	99パーセント
DOPCの	アヴァンティ	850375P
エグタ	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	A0878	99パーセント
ヘープス	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	A1069(英語
メタノール	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	A3493
PIP2	アヴァンティ	850155P
ポップ	アヴァンティ	850457P
ポップ	アヴァンティ	840034P
塩化ナトリウム	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	A1149(英語版)
SDSの	ロス	183
クエン酸三ナトリウム	PanReac AppliChem(パンリアックアプリケム	A3901
備品
押出機リポソファスト	アヴェスチン
Qsense E4 アナライザー	Qセンス
QSense Dfind	Qセンス
ポンプ IPC 4	イスマテック	ISM930
QSX 303 SiO2 二酸化ケイ素 50nm	Qセンス	QSXの303
PCメンブレン 0.05μm	Avanti極性脂質	610003
オリジンプロ	株式会社オリジンラボ		バージョン 8 および 9

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