DNAカーテン上の融合タンパク質凝縮物の集合を可視化するための1分子イメージング

要約

出典: Zuo, L. et al., DNA上のEWS-FLI1凝縮物の単一分子イメージング。 (2021年)

この動画では、特定の遺伝子座におけるDNA分子上の融合タンパク質凝縮物の集合を、1分子イメージングを用いて可視化する方法を説明しています。これらの凝縮物は、LCD-LCDおよびLCD-DBDの相互作用によって形成され、RNAポリメラーゼIIの動員と遺伝子転写の促進を可能にします。

プロトコル

>1. DNAカーテン上のEWS-FLI1凝集形成のイメージング

1. イメージングソフトウェアを開き、明視野の下の3つ×3つのジグザグパターンの位置を見つけてマークします。
2. 0.2 mL/minでフローをオンにして、二本鎖DNA色素でDNAを10分間染色します。
3. mCherry-EWS-FLI1をイメージングバッファーで希釈し、チューブ内100 μL中100 nMに希釈します。
4. タンパク質サンプルを 100 μL ガラス製シリンジでバルブにロードし、流速を 0.4 mL/min に変更します。
5. 488 nm レーザーをオンにし、各領域を事前にスキャンして DNA の分布状態を確認します。DNA 分子が均等に分布している領域を選択します。レーザー出力を 10nm レーザーの場合は 488%、561 nm レーザーの場合は 20% に設定します。パワーメータを使用して、プリズム付近の実際のレーザーパワーを測定します(488nmレーザーの場合は4.5mW、561nmレーザーの場合は16.0mW)。
6. 画像取得
   1. 488 nm レーザーと 561 nm レーザーの両方を同時に使用して、2 秒間隔で画像の取得を開始します。
   2. バルブを手動モードから注入モードに変更して、イメージングバッファーが 60 s.
      の後にタンパク質サンプルをフローセルにフラッシュします 手記： このプロセスには~30秒かかり、EWS-FLI1タンパク質がフローセルに到達するとすぐに視野がmCherryシグナルで覆われます。
   3. 遊離EWS-FLI1を除去するには、561 nmレーザーのみをオンにして、フローセルをイメージングバッファーで5分間洗浄し続けます。流れを止め、37°Cで10分間インキュベー
   トします。
   4. 0.4 mL/分でフローをオンにしてDNAを伸長させ、異なるフレーム間で2秒間隔で画像を取得して、EWS-FLI1凝縮物形成のハイスループットデータを取得します。

2. mCherry-EWS-FLI1の強度解析

1. データを画像シーケンスとしてImageJソフトウェアにインポートし、8×8ピクセルの正方形で25×GGAAサイトの点数を選択し、画像を.tif形式で保存します。
2. 8×8 ピクセルの正方形 (puncta 全体を含む) の強度の合計として強度を計算し、8x8 ピクセルの正方形の近くの同じサイズの領域の背景の強度を差し引いて背景を削除します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
488 nm ダイオード励起固体レーザー	コヒーレント	OBIS488LS
561 nm ダイオード励起固体レーザー	コヒーレント	OBIS561LS
ニコン倒立顕微鏡	ニコン	エクリプスTi
PMMAの	PMMAの	プライム95B