タンパク質-ホスホイノシチド相互作用を検出するための担持脂質二重膜のpH調節アッセイ

要約

出典: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、マイクロ流体プラットフォームと呼ばれる担持脂質二重膜のホスファチジルエタノールアミン脂質にタグ付けされたpH感受性蛍光色素を使用して、pH調節アッセイを使用して、マイクロ流体パターンでのタンパク質-ホスホイノシチド相互作用を示しています。タンパク質がリン脂質に結合した後のpHの調節は、蛍光消光を引き起こします。

プロトコル

1. 支持脂質二重層(SLB)の形成

1. 100 μL の PI(4,5)P2 含有 SUV を 0.65 mL の微量遠心チューブに移します。0.2 N 塩酸 6.4 μL を加えて、溶液の pH を ~3.2 に調整します。
   手記：マイクロpHプローブを搭載したpHメーターで溶液のpHを確認します(材料の表を参照)。
2. pH調整したSUV溶液10μLを入口から各チャネルにピペットで注入し、溶液が出口に到達するまでピペットで圧力をかけます。チップをピペットから取り外し、デバイスに接続したままにします。
3. 各チャンネルについて上記の手順を繰り返し、デバイスをRT.
   で10分間インキュベートします 手記：マイクロチャネルへの小胞の注入は、デバイスの組み立て直後に行う必要があります。
長さが
4. それぞれ60 cm(インレットチューブ)と8 cm(アウトレットチューブ)のインレットチューブとアウトレットチューブのセットを切り取ります。
   手記：チューブを斜めに切断し、鋭いエッジを作成すると、チューブをインレットとアウトレットに挿入しやすくなります。アウトレットチューブは円弧状にする必要があります。インレットチューブの長さは、顕微鏡のセットアップによって異なる場合があります。チューブの内径は0.05cmです。
5. ピンセットを使用して、アウトレットチューブセットをデバイスに接続し、デバイスを顕微鏡ステージにテープで貼り付けます。
6. インレットチューブセットの一端を円錐形チューブに入った25 mLのランニングバッファーに浸し、テープで固定します。
7. コニカルチューブを装置よりも高い地面(~20cm)に置くと、重力流を介して溶液がマイクロチャネルに押し込まれます。これを達成するためには、ラボジャッキを使用することができます。
8. インレットチューブごとに、シリンジを使用して、チューブの自由端から1 mLのランニングバッファーを引き出します。ピペットチップをインレットから取り外し、インレットチューブの自由端をデバイスに挿入します.
   手記：インレットにランニングバッファーを一滴導入して、このステップ中に気泡がチャネルに導入される可能性を減らします。インレットチューブをデバイスに接続した後、糸くずの出ないワイプを使用して余分なバッファーを取り除きます。
9. 上記の手順を繰り返して、すべてのインレットチューブピースをデバイスに接続します
   手記：チャネルに流れるランニングバッファーは、余分な小胞を除去し、二重層を実験条件に平衡化するのに役立ちます。
10. 顕微鏡制御ソフトウェアを開きます(資料の表を参照)。左側のパネルで、「顕微鏡」タブをクリックし、「10X」対物レンズを選択します。
11. ツールバーの「ライブ」をクリックし、次に「Alexa568」画像アイコンをクリックします。微調整ノブとコース調整ノブを使用して、マイクロチャネルに焦点を合わせます。
12. デバイスをスキャンして、SLBとチャネルの品質を確認します(図1)。次に、ツールバーの「FLシャッタークローズ」画像アイコンをクリックします。
13. 「Acquisition」タブをクリックし、「Basic adjustments」で「Exposure time」を選択し、露光時間を「200ms」に設定します。
14. 左側のパネルで[Multidimensional Acquisition]をクリックし、フィルターメニューの下で赤いチャンネル(「Alexa 568」とマークされています)を選択します。次に、「タイムラプス」メニューをクリックし、時間間隔を5分、期間を30分に設定して、「開始」をクリックします
    手記：持続時間(30分)と流速(~1.0 μL/min)に基づいて、30 μLのランニングバッファーを使用してチャンネル内のSLBを平衡化します。つまり、240 μLのランニングバッファーが8つのチャンネルすべてに使用されます。
15. 「測定」タブの下の「円」ツールを選択し、任意のチャネルに円を描きます。円を選択した状態で右クリックし、「プロパティ」を選択します。「Profile」タブで「all T」にチェックを入れ、蛍光強度を時間の関数として表示します。
    1. 次のステップに進む前に、この曲線が平衡を示すプラトーに達していることを確認してください。
16. 緩衝液をデバイスと同じ地面に下げて、流れを止めます。
17. タイムラプスファイルを保存します。

>2. PLC-δ1 PHドメインとPI(4,5)P2含有SLBとの相互作用のテスト

1. PHドメインの希釈液を調製するには、ランニングバッファーを希釈剤として使用します.
   手記： デバイス内には8つのチャネルがあるため、ブランクコントロールには少なくとも2つを使用します。両側の遠端を選択し、残りのチャネルをタンパク質の希釈に使用します。次のPHドメイン濃度を試験しました:0.10、0.25、0.50、1.00、および2.50μM.各希釈液の約200μLは、30分以内に平衡に達するのに十分でした。
2. 一度に1つずつ、各アウトレットチューブを取り外し、ピペットを使用して各タンパク質希釈液200μLをアウトレットチャネルに適用します。圧力をかけず、重力に任せてください。チップをピペットから取り外し、マイクロ流体デバイスに取り付けたままにします。
3. チャネルごとに上記の手順を繰り返し、このプロセス中に気泡がチャネルに導入されないことを確認します。
4. インレットチューブをマイクロ流体デバイスの下の地面まで下げて、マイクロチャネルを介してタンパク質の流れを開始します。チューブの自由端を廃棄物容器にテープで固定します。タンパク質希釈液を30分間流します.
   手記：これにより、流れが逆転し、タンパク質をチャネルに導入できるようになります。平衡化までの時間と必要なタンパク質希釈の量は、相互作用の親和性に依存します。
5. ソフトウェアの左側のパネルの[タイムラプス]タブで、[開始]をクリックしてイメージングを再開します。
6. 実験が完了したら、タイムラプスファイルを保存してください。

結果

図1:SLBとマイクロチャネルの完全性の評価。(A)高品質のSLBとマイクロチャネルを示す画像。(B)不完全融合。 (C)融合マイクロチャネル。(D)マイクロチャネル内に閉じ込められたダスト粒子。(E)マイクロチャネル内に閉じ込められた気泡。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	850457C	ポップ
L-α-ホスファチジルイノシトール-4-リン酸	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	840045X	PI4P(パイフォーピー)
L-α-ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	840046X	PI(4,5)P2
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン	Avanti Polar Lipids(アバンティポーラーリピッド)	850757C	教皇;oSRB-POPEの合成に必要
リサミン、ローダミン、Bスルホニルクロリド(混合異性体)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L-20	oSRB-POPEの合成に必要
pH感受性蛍光脂質プローブ(oSRB-POPE)	社内	該当なし	インハウス合成 (Huang D. et al. 2013)
Axiovert 200M 落射蛍光顕微鏡	カールツァイス顕微鏡	該当なし	顕微鏡
AxioCam MRmカメラ	カールツァイス顕微鏡	該当なし	カメラ
X-Cite 120 (英語	エクセリタス・テクノロジーズ	該当なし	光源
Alexa 568フィルターセット	カールツァイス顕微鏡	該当なし	Ex/EM 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0ソフトウェア	カールツァイス顕微鏡	該当なし	画像処理ソフトウェア
ヒント	VWRの	10034-132	200 uLピペットチップ;タンパク質溶液をマイクロ流体チャネルに適用するための薄くて滑らかなチップ
ヒント	VWRの	53509から070	10 uLピペットチップ;細くて滑らかな先端で、小胞溶液をマイクロ流体チャネルに適用します
オリオンスターA321 pHメーター	サーモサイエンティフィック	STARA3210	pHメーター
オリオンマイクロpHプローブ	サーモサイエンティフィック	8220BNWPの	マイクロpHプローブ
N-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)	VWRの	VWRB30487	HEPES、遊離酸
塩化ナトリウム	VWRの	BDH8014-2.5KGR	NaCl
チューブ	Allied Wire & Cable (アライド ワイヤー & ケーブル)	TFT-200-24 N	内径:0.020-0.026インチ(0.051-0.066 cm);壁の厚さ:0.010インチ(0.025 cm);柔軟なポリテトラフルオロエチレン薄肉チューブ。ナチュラルカラー
窒素ガス - 工業用	プラクスエアー	該当なし	ローカルプロバイダー
酸素ガス - 工業用	プラクスエアー	該当なし	ローカルプロバイダー
液体窒素	プラクスエアー	該当なし	ローカルプロバイダー

) の