タンパク質-リガンド相互作用をモニタリングするための定量的細胞内水素NMR分光法

要約

出典:Barbieri, L. et al., 高細胞密度バイオリアクターを用いたリアルタイム定量的インセルNMRによるヒト細胞内のタンパク質-リガンド相互作用のモニタリング。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、非標識過剰発現タンパク質と低分子との間のタンパク質-リガンド相互作用を研究するための細胞内核磁気共鳴分光法を実演します。リガンド-タンパク質相互作用の成功は、目的のスペクトル領域に追加のピークセットが出現し、元のピークが徐々に置き換えられることによって視覚的に確認されます。

プロトコル

1. 試薬と溶液のセットアップ

1. 完全なDMEMを調製するには、5 mLのL-グルタミン200 mM、5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン100x、および50 mLのウシ胎児血清(FBS、10% vol/vol最終濃度)を440 mLのDMEMに加えます><。 手記：この溶液は、4°Cで1ヶ月間保存できます。
2. 150 mgの低ゲル化アガロースを10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に85°Cで溶解してアガロース溶液を調製し、1.5%(w / v)溶液を得ます。0.22μmフィルターによるろ過により滅菌します。1.5 N中に1 mLのアガロース溶液を調製します
。
3. バイオリアクター培地を準備します。
   1. 13.4 gのDMEM粉末を1 Lの超高純度_H2O.
      に溶解します 手記：用途に応じて、必要な最終容量が異なる場合があります(たとえば、500 mLの培地の場合、6.7 gの粉末を500 mLのH₂Oに溶解します)。
   2. 2% FBS、10 mM NaHCO₃、1x ペニシリン-ストレプトマイシン (100x)、および 2% D₂O を添加します (例: 500 mL 培地の場合、10 mL の FBS、0.4 g の NaHCO₃、5 mL のペニシリン-ストレプトマイシン 100x、および 10 mL の D₂O を添加します)。
   3. pHメーターを使用してpHを測定し、必要に応じてHCl.
      を追加して7.4に調整します 手記：通常、初期pHは7.4に非常に近いです。
   4. バイオリアクター培地を真空駆動の滅菌フィルターで滅菌した250 mLまたは500 mLのガラス瓶でろ過します。
   5. 層流フードで、2つのホースノズルを備えた滅菌スチール製ヘッドピースでボトルを密封し、ポンプと空気取り入れ口用の0.22μmPTFEシリンジフィルターに接続されるFEPチューブ(ø.d. = 1/8"、i.d. = 1.6 mm)に接続します。

>2. バイオリアクターのセットアップ

1. 2本目のフローユニットNMRチューブを使用してフローユニットを組み立てますが、これは後で細胞が入ったものと交換されます。正しい組み立てについては、フローユニットの操作説明書を参照してください。
   手記：この時点で、フローユニットはすでに清掃されているはずです(そうでない場合は、手順4.2を実行します)。
2. フローユニットの温度制御に接続されたウォーターバスを37°Cに設定し、リザーバーボトルをウォーターバスに入れます。
3. リザーバーボトルのFEPチューブをポンプに接続します。
4. バイオリアクターバルブを「バイパス」に回し、ポンプに媒体を事前に充填します。
5. バイオリアクターバルブを「フロー」に回し、バイオリアクターに培地を0.1 mL/minで事前に充填します。

3. 細胞サンプルの調製

1. CO₂インキュベーターから細胞を採取します。
   1. トランスフェクションしたHEK293T細胞のT75フラスコを_CO2インキュベーターから取り出し、使用済みの培地を取り出します。
   2. 室温(~20°C)で7 mL(各)のPBSで細胞を2回洗浄します。
   3. 2mLのトリプシン/EDTAを使用して細胞を剥離します。溶液を添加した後、室温で5分間インキュベートして細胞を剥離します
      手記：トランスフェクションされた細胞は、分離するのに少し時間がかかる場合があります。必要に応じて、細胞を37°Cでインキュベートします。
   4. 20 mLの完全DMEMでトリプシンを不活性化し、ピペッティングで上下させ、50 mLの遠心チューブに移すことで、細胞を完全に再懸濁します。
   5. 細胞を800 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   6. 細胞を室温で10 mLのPBSで洗浄し、残留培地を除去します。
   7. 細胞を800 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   8. 細胞ペレットをキャップ付きの1.5mLの微量遠心チューブに移します。
2. アガロース糸にセルを埋め込みます。
   1. 凝固したアガロースの1アリコートを85°Cのウォーターバスで溶かし、続いてブロックヒーターで37°Cの溶液に保持します。
   2. パスツールピペットを使用して、フローユニットNMRチューブの底に60-70μLの1.5%アガロースゲルを充填し、氷の中に置きます。これにより、高さ~5mmの底部プラグが作成され、^1HNMRコイルの活性体積内に細胞サンプルを配置できます。
   3. ステップ3.1.8で得られたセルのペレットを、サーモブロック内で37°Cで15-20秒間加熱します。
   4. 細胞を450 μLのアガロース溶液に再懸濁します。気泡の発生に注意して下さい。
   5. 細胞アガロース懸濁液を、1 mL シリンジに接続された長さ ~30 cm のクロマトグラフィー PEEK チューブ (i.d. = 0.75 mm) に吸引します。 (
      手記：吸引する前に、チューブとシリンジのデッドボリュームに室温でPBSを事前に充填して、気泡の形成を防ぐ必要があります。チューブの長さは重要ではありません。
   6. チューブを室温で2分間冷まします。
   7. フローユニットNMRチューブに室温で100μLのPBSをプレフィルします。
   8. シリンジを軽く押して、アガロースに包埋された細胞の糸をフローユニットNMRチューブにキャストします。
      手記：NMRチューブを均一に充填するには、まずPEEKチューブの端をNMRチューブの底部に配置し、ゆっくりと左右に揺らしながら上部に向かって進みます。
   9. すべてのセルアガロース懸濁液がキャストされるまで、手順3.2.5、3.2.6、および3.2.8を繰り返します。
3. バイオリアクターに細胞を挿入します。
   1. 空のNMRチューブをフローユニットから取り外し、流量を2 mL/minに数分間増やして、インレットチューブに残留する気泡を取り除きます。
   2. 流速を0.2mL/minに設定し、細胞が入ったNMRチューブをゆっくりと着実に押し上げて挿入します
      手記：媒体の活発な流れは、挿入中に発生する入口を通るチューブ内容物の逆流を回避します。

>4. バイオリアクターの操作と洗浄

1. NMR実験中のバイオリアクター操作。
   1. NMR分光計の温度を310Kに設定します。
   2. フローユニットを分光器に挿入します。
   3. バイオリアクター培地を0.1 mL/minの流速で、細胞内NMR実験の全期間にわたって供給します。
   4. 実験中の所望の時間に、滅菌ロングニードルシリンジでシリコンチューブを貫通することにより、外部分子の濃縮溶液を培地リザーバーボトルに注入します。
      手記：培地中の分子の最終濃度は、細胞毒性に関する以前の知識に基づいて選択し、可能な場合は、細胞膜を通る予測/推定拡散速度に基づいて選択する必要があります。
   5. NMR実験の最後に、細胞の入ったチューブを空のチューブに交換し、フローユニットを水ですすいでください。
2. バイオリアクターは定置洗浄。
   1. 0.2 M 水酸化ナトリウム(NaOH)、3 M クエン酸、0.2 M NaOH をそれぞれ 30 分以上流し、その後、滅菌ろ過した超純水を >2 時間、1 mL/分で
   洗浄します。
   2. 各実行後に、リザーバーボトルとチューブアセンブリを清掃してオートクレーブします。

5. NMR実験

1. NMR実験のセットアップ.
   手記：これらの手順を事前に実行して、細胞採取とデータ取得の間の遅延を避けるために、インセルNMRサンプルを調製してください。
   1. NMR分光計で新しいデータセットを作成し、目的のNMR実験のパラメータを設定します。
   2. 1D ¹H NMR実験のパラメータを設定します。
   3. ¹H キャリア周波数を 4.7 ppm の水信号の中央に配置します。
   4. zgesgp パルス プログラムを選択し、スペクトル幅を 20 ppm に設定し、水抑制用に 1,000 μs の 180° 方形パルスを設定します。スキャン間遅延を 1 秒に設定します。32回のスキャンでスペクトルを取得します。
   5. 非標識CA IIを発現する細胞の場合:p3919gpパルスプログラムを選択し、スペクトルのイミノ領域をカバーするためにスペクトル幅を30ppmに設定し、最大励起が対象シグナルの化学シフト(d7 = 20 μs、950MHz)に集中するように二項水抑制の遅延を調整します。スキャン間遅延を ≥1 秒に設定します。512スキャンで取得します。
   6. ¹⁵N標識SOD1を発現する細胞の場合:sfhmqf3gpphパルスプログラムを選択し、¹Hおよび¹⁵Nのスペクトル幅をそれぞれ16および50 ppmに設定し、成形パルスオフセットおよび励起帯域幅をそれぞれ8.5および6 ppmに設定し、デカップリングスキーム(装置に応じてgarp4またはその他)用に350μsパルスを設定します。スキャン間遅延を 0.3 秒に設定します。^15N次元で16スキャンと128インクリメントを取得します。
2. リアルタイムのNMRスペクトル取得。
   1. バイオリアクターをNMR分光計に挿入したら、培地の交換を待つまで数分待ちます。
      手記：このプロセスは、PBSが2%_D2Oを含む媒体に置き換えられるときに、ロック信号の外観から簡単に監視できます。
   2. ¹Hチャンネルのマッチングとチューニングを調整し、磁石をシムして、¹H 90°のハードパルス長を計算します。
   3. 各パルスシーケンスの^1H電力レベルを^1Hハードパルスに応じて調整します。
   4. 最初のzgesgp ¹Hスペクトルを記録して、サンプルの内容とフィールドの均一性を確認します。
   5. zgesgp と p3919gp/sfhmqcf3gpph の実験を必要な数にコピーし、それらを取り込みスプーラにキューに入れます。
      ca:zgesgpスペクトルは、サンプルの状態とフィールドの均一性を制御するためにのみ使用されます。したがって、スキップするか、記録の頻度を減らすことができます。
   6. 非標識CA IIを発現する細胞の場合:ゼロフィルと指数関数的線拡幅ウィンドウ関数(LB = 20 Hz)を適用して、p3919gpスペクトルを処理します。
   7. ¹⁵個のN標識SOD1を発現する細胞の場合:ゼロフィルディングと二乗正弦ベルウィンドウ関数(SSB = 2)を両次元に適用して、sfhmqcf3gpphスペクトルを処理します。
      手記：処理されたスペクトルのサイズは、信号のない領域を削除することでさらに縮小できます(Topspinでは、これは目的のSTSRおよびSTSI値を設定することによって行われます)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
料
クエン酸	シグマ・アルドリッチ	251275
D2O(ディーツーオー)	シグマ・アルドリッチ	453366
DMEM, 高グルコース	ライフテクノロジー	〒10313-021
DMEM, 高グルコース, 粉末状	シグマ・アルドリッチ	D5648
FBSの	ライフテクノロジー	10270
HCl	シグマ・アルドリッチ	30721
L-グルタミン (200 mM)	ライフテクノロジー	25030
低ゲル化アガロース、粉末	シグマ・アルドリッチ	A4018の
NaHCO3、粉末	カルロ・エルバ	478537
PBSの	ライフテクノロジー	10010
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)	ライフテクノロジー	15140-122
NaOHペレット	シグマ・アルドリッチ	30620
トリプシン-EDTA(0.05%(wt/vol))	ライフテクノロジー	〒25300-054
備品
Avance III 分光計 (5 mm CryoProbe 搭載	ブルカー	該当なし	最新の分光器と5mmプローブを装備した小口径磁石はすべて互換性があります。
InsightMRフローユニット	ブルカー	該当なし
ÄKTA FPLCのP-920ポンプモジュール	GEヘルスケア	該当なし	FPLC、HPLCチューブポンプ、またはシリンジポンプは、フローユニットと互換性がある必要があります。

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