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>注:以下は、QCMバイオセンサーを使用して薬物認識T7ファージをスクリーニングし、大腸菌(BLT5615)感染を介してスクリーニングされたファージを回復するための手順です。自己組織化単分子膜(SAM)を形成する低分子の誘導体の合成、およびT7ファージディスプレイ15量体ランダムペプチドライブラリーの構築のためのプロトコールは、他の場所で見つけることができます。
1. QCMセンサーチップの準備
- 27MHzのQCM装置の発振器にセラミックセンサチップを取り付け、低分子固定化前の気相の固有周波数(Hz)を記録します。
- チップを取り外し、SAMを形成する低分子誘導体の溶液(70%エタノールで1 mM)をピペットを使用してセンサーチップの金電極に20μL滴下します
注意：金電極(Au、0.1mm厚、内径2.5mm、内径4.9mm2)が位置するセンサーチップの水晶は、非常に薄く、割れやすい(SiO2、0.06mm厚、内径9mm)ことがあります。したがって、慎重にピペットを動かしてください。
- 室温(約20°C)で1時間、湿らせたティッシュを入れたシャーレに入れ、室内の照明から遮蔽します。
- 電極表面を超純水でやさしく洗浄し、シリンジやエアダスターでエアを吹き付けて水滴を取り除きます。
- QCM装置用のセンサーチップをセットし、気相の周波数低下を記録することで、固定化した小分子の量を計測します
手記： 少なくとも、低分子の固定化を成功させるには、100Hzの固有周波数が必要です(1Hzは30pgを固定化します)。
>2. QCMバイオセンサーを用いたT7ファージライブラリーのバイオパンニング(図1)
- 専用のマグネチックスターラー付きキュベットをQCMバイオセンサーにセットし、8 mLの反応バッファー(10 mM Tris-HCl、200 mM NaCl、pH 7-8)をキュベットに注ぎます。
- QCMセンサーチップを発振器に取り付け、発振器のアームを引き下げて、1000rpmで攪拌されているバッファーにチップを浸します。
- パーソナルコンピュータ(PC)でQCM周波数のモニタリングを開始し、センサーグラムが周波数ドリフトの約3 Hz / minに平衡化するまで待ちます。
- T7ファージライブラリー(1-2 × 1010 pfu/mL)8 μLをキュベット(最終濃度:1-2 × 107 pfu/mL)に注入し、センサーの注入ポイントをマークします。
- T7ファージが金電極表面に固定化された小分子に10分間結合することによって引き起こされる頻度低下をモニターします。
- QCM周波数モニターを停止し、センサーチップを発振器から取り外し、空気を吹き込むかワイプで吸い上げてバッファーを取り外します。
- センサーチップを湿ったシャーレに入れ、大腸菌(BLT5615)の懸濁液20μL(IPTGを1 mMに添加して37°Cで振とうした後、OD600 = 0.5-1.0)を対数相の宿主細胞に滴下します。
- 皿の蓋を閉め、アルミホイルで覆って光を遮断します。
- 96ウェルマイクロプレートミキサー(1000-1500 rpm)で皿を37°Cで30分間インキュベートし、結合したT7ファージの回収を促進します。
- 溶液の20μLを回収し、LB培地200μLに懸濁します><。
手記： このステップで得られたサンプルは、4°Cで1週間保存できます。
- プラーク単離およびDNAシーケンシング用のファージ溶液の希釈シリーズを、製造元の指示書に記載されている一般的な手順に従って調製します。
