タンパク質オリゴマーのためのマルチアングル光散乱を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

要約

出典:Some, D. et al., Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)とマルチアングル光散乱(MALS)の能力を活用するSEC-MALSについて説明しています。SEC-MALSでは、SECはタンパク質またはタンパク質複合体をそのサイズに基づいて分離し、MALS検出器は分子によってさまざまな角度で散乱された光の強度を測定することにより、平均分子量を決定します。

プロトコル

1. システムの準備

1. MALS検出器とdRI検出器をFPLCのUV検出器の下流に接続します。pH検出器と導電率検出器は、UV検出器とMALS検出器の間に検出器間の体積が大幅に追加されるため、バイパスします。カラムから検出器まで、および検出器間では内径0.25mmのキャピラリーチューブを使用し、検出器の出力には内径0.75mmのキャピラリーチューブを使用して廃棄物またはフラクションコレクターにします。
2. UV検出器からMALSアナログ入力へのアナログ出力、FPLCからMALSオートインジェクションへのデジタル出力など、FPLCと検出器間の必要な信号接続が確立されていることを確認します。
3. 少なくとも 20 kDa から 500 kDa の分画範囲をカバーする適切な分析 SEC カラムを取り付けます。製品情報を確認して、カラムがサンプルと移動相のMW、pH、およびその他の特性の範囲に適しているかどうかを判断してください。

2. バッファの準備、夜間のシステムフラッシュ、清浄度の確認

1. HPLCグレードの試薬を使用して、50-100 mM NaClを含む1 Lのリン酸緩衝生理食塩水を調製します。ボトルトップポリエーテルスルホンフィルターなどを使用して、バッファーを0.1μmにろ過します。最初の50〜100mLの緩衝液を廃液ボトルにろ過して廃棄し、ドライフィルターから微粒子を除去し、残りをろ過した脱イオン水で徹底的に洗浄し、ほこりの侵入を防ぐために蓋をした清潔な滅菌ボトルにろ過します
   手記： Trisバッファーなどの他の移動相溶媒は、それらの溶媒に優先的に溶解する追加のタンパク質を分析する場合に使用できます。
2. 0.5 mL/minの流速で、またはカラムメーカーが推奨する別の方法で一晩フラッシュして、バッファー内のカラムを平衡化し、微粒子を除去します。FPLCの連続フローモードを使用し、すべてのSEC-MALSの実行が完了するまでフローが停止しないことを確認します。
   1. オーバーナイトフラッシュ中にdRIフローセルをパージモードにします。サンプル分析を開始する前に、パージをオフにしてください。
   2. フラッシュを開始するときは、カラム内の圧力の急激な変化によって引き起こされる「カラムの脱落」効果(または粒子の放出)を防ぐために、流量を徐々に増やします。
   3. システムが非常に安定しており、粒子がなく、目的の移動相と平衡状態にあることがわかっている場合は、オーバーナイトフラッシュを2〜3時間の短いフラッシュに交換します。
3. カラムの下流にあるチューブを軽くたたいて蓄積した粒子を放出し、MALS機器のフロントパネルディスプレイにある90°検出器で信号を観察することにより、システムの清浄度を確認します。ピークtoピークノイズが50〜100μV以下であることを確認します。
4. 「ブランク」インジェクションを実行して、インジェクターにパーティクルがないことを確認します。「ブランク」とは、単にランニングバッファーであり、新鮮な滅菌バイアルで調製されます。
   1. 粒子のピーク容量が 1 mL 以下で、ベースラインより 5 mV 以下であれば、システムはサンプルの準備ができています。それ以外の場合は、洗浄されるまで追加のブランク注入を行うか、インジェクターを洗浄するためのメンテナンスを行います。

3. サンプルの準備と読み込み

1. SECバッファーに1-2 mg/mLで少なくとも200 μLのBSAを調製します
   手記：降水を防ぐために、BSAは決して純水に溶かしてはいけません。
2. シリンジチップフィルターを使用してタンパク質を0.02μmにろ過します。
3. ドライフィルターから粒子を除去するために、濾液の最初の数滴を廃棄します。
4. あるいは、サンプルを10,000 x gで15分間遠心分離して、不溶性凝集体やその他の大きな粒子を沈殿させます。
5. 100 μLのBSA溶液をループに注入します.
   手記：これは推奨される材料量であり、安定性や利用可能性などのサンプルの状況に応じて多かれ少なかれ注入できます。1回の注入に必要なタンパク質の量は反比例し、分子量が33 kDaまたはBSAの半分の場合、必要なタンパク質質量は2倍になります。

4. MALS ソフトウェアの準備

1. 新規オープン | MALSソフトウェアメニューのメソッドから実験し、光散乱システムメソッドフォルダーからオンラインメソッドを選択します。DLS検出器が存在する場合は、Light Scattering |QELSフォルダ付き。
2. 「Configuration」セクションで、サンプルと移動相のパラメーターを設定します。
   1. Generic Pumpビューで、流量をFPLCで使用される流量に設定します。
   2. 「Generic Pump」ビューの「Solvent branch」の「Name」フィールドで、「PBS」を選択します。
   3. Injector ビューの Sample branch で、Name に BSA を入力し、dn/dc = 0.185 (未修飾タンパク質の標準値)、A2 = 0、UV 吸光係数 = 0.667 mL/(mg-cm).
      を設定します。 手記：他のタンパク質については、UV₂₈₀ nmの吸光係数が文献に記載されているか、さまざまなパブリックドメインのソフトウェアツールを使用してその配列から計算される場合があります。
[
3. Procedures]セクションの[Basic Collection]ビューで、[Trigger on Autoinject]チェックボックスを選択し、分析時間を70分に設定して、SECカラムの合計透過量に達するまで溶出全体のデータが収集されるようにします。
   手記：必要な時間はカラムによって異なる場合があり、標準的な 7.8 mm × 300 mm HPLC-SEC カラムを 0.5 mL/min で行うには、35 分の回収が必要です。
4. MALSソフトウェアで実験を開始するには、[実行]ボタンをクリックします。FPLC機器からMALS検出器を介してパルス信号を受信した後、データの読み取りを開始します。
5. dRI信号をゼロにするには、機器のフロントパネルにあるAutozeroボタンをクリックします。

5. FPLCソフトウェアの準備

1. FPLCソフトウェアのマニュアル|手動指示の実行 |マークを設定します。
2. インジェクションバルブを手動負荷から流路下のインジェクションに切り替える |インジェクションバルブ。
3. I/Oボックスの下に0.5秒のパルスを挿入してパルス信号を含める |パルスデジタル出力。これにより、MALS ソフトウェアでのデータ収集がトリガーされます。

6. サンプルをループに挿入します。FPLCソフトウェアのExecuteをクリックして、実験の実行を開始します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AKTAピュア	GEヘルスケア	29-0182-26	高速タンパク質液体クロマトグラフ(FPLC)
AKTA ユニコーン	GEヘルスケア		FPLC制御ソフトウェア
アストラ	ワイアットテクノロジー		MALSデータ取得および解析ソフトウェア
ウシ血清アルブミン(純度>97%)	シグマ	A1900(エー1900	分析対象物
DAWNまたはminiDAWN	ワイアットテクノロジー	WH2 または WTREOS	WH2 または WTREOS
200 10/300の増加	GEヘルスケア		サイズ排除カラム、200 Å 細孔、内径 10 mm、長さ 300 mm
OptiLabの	ワイアットテクノロジー	WTREXの	示差屈折率(RI)検出器
塩化ナトリウムNaCl	シグマ	71382	HPLCグレードのNaCl
ステリカップ ボトルトップフィルター ポリエーテルスルホン 0.1 μm 1000 mL	ミリポア	ミリポア	移動相フィルター
Whatman Anotop 10 シリンジフィルター 0.02 μm	GEヘルスケア	〒6809-1002	サンプルフィルター
Whatman Anotop 10 シリンジチップフィルター、孔径 0.1 μm、直径 10 mm G	GEヘルスケア	〒6809-1012	サンプルフィルター
Whatman Anotop 25 シリンジフィルター 0.1 μm	GEヘルスケア	6809-2012	移動相フィルター
ワイアットQELS	ワイアットテクノロジー	WIQの	動的光散乱検出器