相互作用する2つのタンパク質を単離するための二分子相補的アフィニティー精製

Abstract

出典:Hastings, J. F. et al. Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

この動画では、コンフォメーション特異的なシングルドメイン抗体を用いて特異的なタンパク質二量体を検出・単離するためのBiCAPという二分子相補型アフィニティー精製のデモを行っています。

Protocol

1. 細胞培養とトランスフェクション

>注:BiFCベクターのトランスフェクションでは、高効率で比較的均質なトランスフェクションを達成することが重要です。ベクターは、任意の標準的なトランスフェクション試薬と互換性がある可能性が高く、それに応じてトランスフェクション条件を最適化する必要があります。質量分析を行うには、通常、10 cmのディッシュ内で細胞を培養しますが、必要な材料が少ない実験では、より小さなディッシュやプレートに比例してスケールダウンすることもできます。

1. 10 cm皿に10 cm皿に1.0 × 10⁶ HEK293T細胞を播種し、10 mLのDMEM培地を添加し、10% FBSとペニシリン/ストレプトマイシンを添加します(1:100)。
2. 各BiFCベクター2.5 μgを1.5 mLの微量遠心チューブで500 μLのトランスフェクションバッファー(材料表を参照)に希釈します。
3. トランスフェクション試薬10 μLを添加します(材料表を参照)。
4. 混合物を10秒間ボルテックスし、その後短時間遠心分離します。室温で10分間インキュベートします。
5. DNAトランスフェクション混合物をプレートに滴下します。BiFC融合タンパ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	ギブコ	11995年073	細胞培養
FBSの	ライフ・テクノロジーズ・オーストラリア	10099-141	細胞培養
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフ・テクノロジーズ・オーストラリア	15070-063	細胞培養
jetPRIME トランスフェクションバッファー	ポリプラス	114から15	細胞培養
jetPRIMEトランスフェクション試薬	ポリプラス	114から15	細胞培養
PhosSTOP(ホスファターゼ阻害剤)	シグマ・アルドリッチ	4906837001	細胞培養
EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11873580001	プラスチック製品
セルスクレーパー	ザルシュテット	83.1832
GFP Trap_A	クロモテックGmbH	GTA-100	アガロースビーズに結合したGFPナノボディ
N末端GFPモノクローナル抗体	コーヴァンス	MMS-118Pの	BiFCベクター内のV1タグを検出します
C末端GFPモノクローナル抗体	ロシュ	11814460001	BiFCベクトル内のV2タグを検出します
サンプルバッファー	インビトゲン	NP0008	1 mLのβ-メルカプトエタノールを補充します。
シーケンシンググレードの修飾トリプシン	プロメガ株式会社	V5117Hの	細胞培養
LoBind微量遠心チューブ	ポイントオブケア診断	0030 108 116	プラスチック製品
ヨードアセトアミド	シグマ・アルドリッチ	I1149-5Gの	超純水で5 mg/mLで調製
LTQ Orbitrap Velos Pro	サーモフィッシャー
DH5α細胞	サーモフィッシャー		ヒートショックコンピテントセル