相互作用する2つのタンパク質を単離するための二分子相補的アフィニティー精製

要約

出典:Hastings, J. F. et al. Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

この動画では、コンフォメーション特異的なシングルドメイン抗体を用いて特異的なタンパク質二量体を検出・単離するためのBiCAPという二分子相補型アフィニティー精製のデモを行っています。

プロトコル

1. 細胞培養とトランスフェクション

>注:BiFCベクターのトランスフェクションでは、高効率で比較的均質なトランスフェクションを達成することが重要です。ベクターは、任意の標準的なトランスフェクション試薬と互換性がある可能性が高く、それに応じてトランスフェクション条件を最適化する必要があります。質量分析を行うには、通常、10 cmのディッシュ内で細胞を培養しますが、必要な材料が少ない実験では、より小さなディッシュやプレートに比例してスケールダウンすることもできます。

1. 10 cm皿に10 cm皿に1.0 × 10⁶ HEK293T細胞を播種し、10 mLのDMEM培地を添加し、10% FBSとペニシリン/ストレプトマイシンを添加します(1:100)。
2. 各BiFCベクター2.5 μgを1.5 mLの微量遠心チューブで500 μLのトランスフェクションバッファー(材料表を参照)に希釈します。
3. トランスフェクション試薬10 μLを添加します(材料表を参照)。
4. 混合物を10秒間ボルテックスし、その後短時間遠心分離します。室温で10分間インキュベートします。
5. DNAトランスフェクション混合物をプレートに滴下します。BiFC融合タンパク質が相互作用し、Venusフォールディングと蛍光色素の成熟のために十分な時間(通常は~8 - 24 h.
   )細胞をインキュベートします。 注:金星のピーク励起は515 nmで、ピーク発光は528 nmですが、これはGFP蛍光を視覚化するためにセットアップされた標準的な蛍光顕微鏡を使用して容易に見ることができます。

2. サンプル調製

1. ライセートの収穫
   1. ライセートを採取する前に、Cell Lysis Buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% (v/v) 非イオン性界面活性剤 (材料の表を参照)]を調製します。4°Cで保存してください。
   2. 回収の直前に、10 mLのCell Lysis Bufferにプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を添加します(材料の表を参照)。補充したCell Lysis Bufferを氷上に保存します。
   3. 氷冷したPBSで細胞を2回洗浄します。PBSを吸引し、氷冷を添加したCell Lysis Buffer1 mLを加えます。皿を氷の上に置き、バッファーが表面積全体に広がるようにします。
   4. 氷上で約5分間インキュベートした後、セルスクレーパー(材料表を参照)を使用して細胞を掻き取り、あらかじめ冷却した1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
   5. 回収したライセートを18,000 × g、4°Cで5分間遠心分離して細胞の破片を取り除き、透明化した上清を新しい微量遠心チューブに移します
      手記： この時点で、ライセートはすぐに使用するか、-80°Cで保存することができます。また、トランスフェクションおよびアフィニティー精製の効率を検証できるように、粗溶解物のアリコートを保持することも推奨されます。
2. アフィニティー精製
   手記：BiCAP単離ステップは、アガロースビーズに結合したGFPナノボディを使用して実行されます(材料の表を参照)。
   1. アガロースビーズを調製するには、1 mL PBSで適切な量(サンプルあたり20 μL + 10 μLの過剰量)を洗浄します。ビーズを300 x gで遠心分離し、上清を取り除きます。
   2. 各ライセートサンプルに20 μLを添加します。
   3. サンプルをエンドツーエンドの回転で4°Cで2時間インキュベートします.
      手記：この時点で、サンプルはSDS-PAGEとウェスタンブロッティング、または質量分析による分析のいずれかに調製できます。
3. ウェスタンブロッティング用のBiCAP溶離液の調製。
   1. ビーズを300 x gで遠心分離し、Cell Lysis Bufferで3回洗浄します。
   2. 洗浄したビーズを50 μLの適切に希釈したサンプルバッファー(材料表を参照)に再懸濁し、サンプルを95°Cで2〜3分間加熱します
      手記：この方法で調製したサンプルは、-20°Cで数ヶ月間保存できます。
   3. V1タグとV2タグの両方(材料表を参照)、およびその他の目的のタンパク質について、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを実施します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	ギブコ	11995年073	細胞培養
FBSの	ライフ・テクノロジーズ・オーストラリア	10099-141	細胞培養
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフ・テクノロジーズ・オーストラリア	15070-063	細胞培養
jetPRIME トランスフェクションバッファー	ポリプラス	114から15	細胞培養
jetPRIMEトランスフェクション試薬	ポリプラス	114から15	細胞培養
PhosSTOP(ホスファターゼ阻害剤)	シグマ・アルドリッチ	4906837001	細胞培養
EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11873580001	プラスチック製品
セルスクレーパー	ザルシュテット	83.1832
GFP Trap_A	クロモテックGmbH	GTA-100	アガロースビーズに結合したGFPナノボディ
N末端GFPモノクローナル抗体	コーヴァンス	MMS-118Pの	BiFCベクター内のV1タグを検出します
C末端GFPモノクローナル抗体	ロシュ	11814460001	BiFCベクトル内のV2タグを検出します
サンプルバッファー	インビトゲン	NP0008	1 mLのβ-メルカプトエタノールを補充します。
シーケンシンググレードの修飾トリプシン	プロメガ株式会社	V5117Hの	細胞培養
LoBind微量遠心チューブ	ポイントオブケア診断	0030 108 116	プラスチック製品
ヨードアセトアミド	シグマ・アルドリッチ	I1149-5Gの	超純水で5 mg/mLで調製
LTQ Orbitrap Velos Pro	サーモフィッシャー
DH5α細胞	サーモフィッシャー		ヒートショックコンピテントセル

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