DNAアプタマー-熱不安定性リガンド相互作用を研究するための示差走査熱量測定

要約

出典:Mittermaier, A. K., et al.熱不安定性配位子を用いた生体分子DSCプロファイルの測定により、フォールディングおよび結合相互作用を迅速に特徴付けます。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、生体分子とリガンドの相互作用を研究する手法である示差走査熱量測定を実演しています。DNAアプタマーと熱不安定性リガンドの結合は、サンプルに加熱と冷却のサイクルを繰り返し適用し、熱力学分析のためのスキャンを取得することによって研究されます。

プロトコル

1. サンプル調製

1. 目的の生体分子を精製します.
   手記：このプロトコルは、購入したコカイン結合DNAアプタマーMN4を2 M NaClに対して3回交換した後、3 kDaの分子量カットオフメンブレンを備えた遠心フィルターを使用して3ラウンドの脱イオン水を使用します。
2. 目的の熱不安定性配位子を合成および精製するか、購入します.
   手記：MN4は熱不安定性リガンドコカインに結合します。MN4はキニーネにも結合し、これらの実験温度でのリガンドの熱伝導性のネガティブコントロールとして使用されます。
3. 精製した生体分子の透析およびリガンドの溶解用のバッファーを調製します(MN4およびここで使用するリガンドについては、20 mMリン酸ナトリウムおよび140 mM NaClバッファー、pH 7.4
)。
4. 0.5 - 1.0 kDaのカットオフ電流を設定した透析チューブを使用して、少なくとも2 Lのバッファーに対して生体分子を透析します。
5. 最終バッファー(ワーキングバッファーと呼ばれる)を、バッファーで完全に平衡化した0.2μmフィルターでろ過します。
6. リガンドの所望の質量を秤量し、それらを濾過された作業緩衝液に溶解します。目的のリガンド濃度で質量が小さすぎて正確に計量できない場合は、濃縮されたリガンドストック溶液(たとえば10倍)を作成します。
   手記： すべてのDSC実験では、サンプルとリガンドに同じワーキングバッファーを使用することが重要です。つまり、リガンドが生体分子とは異なるワーキングバッファーのバッチに溶解する実験は、データにバッファーのミスマッチアーティファクトを引き起こすため、絶対に行わないでください。
7. ワーキングバッファーと完全に平衡化された0.2μmフィルターで生体分子ストック溶液をろ過します。
8. 吸光度測定により生体分子濃度を測定します(MN4などの核酸の場合は260 nm、タンパク質の場合は280 nm)。
9. 調製した生体分子とリガンドは、4°Cの冷蔵庫(MN4およびここで使用するリガンドに適しています)で保存するか、生体分子とリガンドが凍結に耐え、長期保存が必要な場合は-20°Cまたは-80°Cで保管します。緩衝液、生体分子、および配位子溶液を卓上型脱気装置(材料表を参照)で脱気してから、DSC.
   手記：脱気は、高温でのDSCでの気泡形成を防ぐのに役立ちます。気泡は、DSCのピーク形状とベースラインを不明瞭にする信号アーチファクトを引き起こします。

2. DSCの準備

1. DSCから圧力ハンドルを緩めます(材料の表を参照)。
2. ワーキングバッファーからシリコンチューブを配線し、リファレンスキャピラリーのフロントフランジ(金属開口部)に取り付けます。
3. 参照キャピラリーとサンプルキャピラリーの間にブリッジを作成するには、背面の参照フランジを前面のサンプルフランジに接続します。
4. シリコンチューブの一部を、真空ラインが取り付けられた廃フラスコに通じる背面のサンプルフランジに取り付けます。
5. バキュームラインをオンにして、DSCを200 mLの作業バッファーで洗い流します。
6. DSCの基準キャピラリーに作業バッファーをロードします。シリコンチューブの約3〜5cmのセクションをリファレンスキャピラリーフランジに取り付けます。
7. 1 mLのピペットチップをリアフランジのシリコンチューブに挿入します。ピペットで0.8 mLの作業バッファーを引き出し、バッファー付きのピペットチップをフロントリファレンスフランジのシリコンチューブに挿入します。
8. ピペットプランジャーを静かに押し下げて、作業バッファーをフロントシリコンチューブからリファレンスキャピラリーに通し、リアフランジに取り付けられたピペットチップに通します。作業バッファレベルが前面シリコンチューブのすぐ上に達するまでピペットプランジャーを押し下げ、次に作業バッファレベルが背面シリコンチューブのすぐ上に達するまでピペットプランジャーを放します。
   1. 作業バッファーを前後に通過させて、参照キャピラリー内のボリュームを気泡からパージします。
      手記：通常、溶液を前後に10回通過させるだけで、気泡を取り除くのに十分です。
9. リアピペットチップを親指でキャップし、リアピペットチップとフロントピペットをそっと引き上げて、シリコンチューブを取り付けたリファレンスフランジから取り外します。
10. ステップ2.6〜2.9のように、サンプルキャピラリーに作業バッファーをロードします。背面のリファレンスフランジとサンプルフランジに黒いプラスチックキャップを取り付け、前面フランジは覆われていない状態にします。
11. 圧力ハンドルを取り付けます。
12. DSCソフトウェアを開き(「資料の表」を参照)、パワーの読み取り値が安定したら、インターフェースの上部にある赤い上向き矢印をクリックして機器を加圧します。DSCの電力は、機器の温度と圧力の読み取り値とともに、インターフェースの右上にあるボックスに表示されます。
    手記：DSCが加圧されるときの電力読み取り値を監視します。~10 μWを超える電力の変化は、毛細血管に気泡が形成されていることを示しており、データにアーティファクトが発生する可能性があります。溶液は、続行する前にさらに除去して脱気する必要があります。
13. フォワードスキャンとリバーススキャンを実行して、DSCを作業バッファーと平衡化します。画面左側の「実験方法」タブで、DSCを温度スキャンモードで実行するために「スキャン」オプションが選択されていることを確認します
    手記：実験パラメータは、スキャン温度範囲、スキャン速度、低温および高温平衡化時間、およびスキャン回数です。
    1. 「実験方法」タブの下の「温度パラメータ」の挿入図で、「加熱」のボタンをクリックします。実験温度の下限と上限に1°Cと100°C、スキャンレートに1°C/min、平衡化期間に60秒を入力します。
    2. 平衡期間の入力フィールドの下にある「シリーズの追加」ボタンをクリックします。ポップアップウィンドウの[追加手順]フィールドに2を入力し(1つの加熱スキャンと1つの冷却スキャンの場合)、[代替加熱/冷却]チェックボックスをオンにします。「OK」をクリックします。追加されたスキャンは、インターフェイスの下部に表示されます。各スキャンのパラメータが希望どおりであることを確認します。
    3. インターフェースの上部にある緑色の [再生] ボタンをクリックして、テストを開始します。目的のフォルダに移動し、ポップアップウィンドウに実験を保存するためのファイル名を入力します。実験の進行状況を表示するには、「実験方法」タブの右側にある「データ」タブをクリックします。

3. 熱不安定性配位子DSCデータセットの収集

>注:最小限の手順は、リガンドの有無にかかわらずバッファー参照実験(ベースライン減算に使用)、遊離生体分子、リガンド結合生体分子、およびより長い高温平衡期間を持つリガンド結合生体分子のサンプル実験の5つの実験で構成されています。

1. サンプルデータのベースライン減算について参照実験を実行します。両方のキャピラリーにワーキングバッファーを入れたDSCを再ロードし、1 °C min-1の適切な温度範囲で複数のフォワードスキャンとリバーススキャンを収集し、上限(高温)平衡化時間を120秒にします。
   1. インターフェースの下部から前のバッファー平衡スキャンを削除するには、各スキャンを個別に強調表示し、インターフェースの右中央にある赤いXをクリックします。「シリーズの追加」ボタンをクリックし、「追加手順」のフィールドに20を入力し、「代替加熱/冷却」ボックスをチェックして、新しいスキャンを追加します。[OK] をクリックし、上記のように緑色の再生ボタンをクリックして実験を実行します。
   2. ステップ 3.1 から 3.1.1 を繰り返して、両方のキャピラリーに所望の濃度のリガンドを含むワーキングバッファーを使用して、リガンドの参照実験を行います (それぞれ 120 秒と 600 秒の高温平衡化時間を使用して 2 つの別々の実験を収集し、熱不安定性リガンド変換の速度定数を取得する際に使用します)
      手記：ここで使用されるスキャンレートは、その後の実験の生体分子がフォワードスキャンとリバーススキャンで熱平衡にあることを保証します。0.1 - 0.2 °C min-1<スキャンレートは、ノイズの多いサーモグラムを引き起こし、DSC実験には適用されません。温度は、遊離生体分子の融解温度をはるかに下回る範囲から、配位子を飽和させた生体分子の融解温度をはるかに超える温度(MN4の場合は~20 - 80°C)まで拡張する必要があります。スキャンの再現性を確認します (たとえば、フォワード スキャン 10 回、リバース スキャン 10 回、合計 20
   回で十分です)。
   3. 複数のリガンド(コカインやキニーネなど)を使用する場合は、キャピラリーからリガンドを除去し、交差汚染を防ぐために、ランの合間に200 mLのワーキングバッファー(ステップ2.5から繰り返す)でDSCをフラッシュします><。 手記： リガンド結合実行後に遊離生体分子で反復実験を行うことは、前のリガンドが毛細血管壁に強く吸着し、バッファーフラッシングで適切に除去されていないかどうかを確認するのに役立ちます。リガンド結合実験後に遊離生体分子のサーモグラムがより大きな大きさとより高い変性温度にシフトしているように見える場合、フラッシング後も前のリガンドが熱量計に残っている可能性があります。プラスチックキャップと圧力ハンドルを外した状態で、キャピラリーを20% Contrad-70と60°Cで1時間インキュベートすることにより、吸着した配位子を取り出します。DSCソフトウェアで、Experimental Methodタブで実験モードを「等温」に変更します。持続時間として3,600秒、等温温度として60°Cを選択し、平衡化時間としてゼロを入力します。「Add to Experimental Method」をクリックします。等温実験が画面下部に表示されます。完了後、装置を2Lの脱イオン水で洗い流し、ステップ2.5から繰り返します。
2. リファレンススキャンと同じDSCローディング手順と実験パラメータを使用して、サンプル実験を実行します。遊離生体分子データセットについては、参照キャピラリーにワーキングバッファーが含まれ、サンプルキャピラリーにワーキングバッファー内の所望の濃度の遊離生体分子が含まれていることを確認してください。
   1. リガンド結合実験では、リガンドが参照キャピラリーのワーキングバッファーにあり、生体分子とリガンドがサンプルキャピラリーのワーキングバッファーにあることを確認します。ステップ2.5のように、異なるリガンドの添加間でシステムをフラッシュします。
3. 熱不安定性配位子に結合した生体分子で、高温平衡期間が600秒に増加し、他のすべての実験パラメータがステップ3.2.1.
   と同じになるように、もう1つの実験を実行します。 手記：第2のリガンド結合実験の高温平衡期間の持続時間は、短平衡化時間実験よりもリガンドが急速に枯渇することを保証するために選択されます。最初の実験でリガンドに結合したピークがスキャン数の関数としてゆっくりと減衰する場合(例えば、連続するピーク最大値の差が0.5°C≤場合)、2回目の実験でリガンドを適切に枯渇させるために、高温平衡化期間で10倍から20倍の増加を推定します。リガンド変換のレート定数を正確に計算するには、2 番目の実験では、1 番目の実験に比べてリガンドの枯渇が速い必要があります。2 つの実験の全体的な解析から抽出されたリガンド濃度は類似しているため、2 番目の実験でリガンドの枯渇が十分に加速されない場合は使用できません。

>4. データ処理

1. DSCデータ解析ソフトウェア(「材料の表」を参照)でDSC実験ファイルを開き、未処理の電力データをスプレッドシートとしてエクスポートします。
2. 生の電力データを含むスプレッドシートをソフトウェアにインポートして、データフィッティングを行います。
3. ベースラインは、遊離およびリガンド結合生体分子実験からバッファーパワーデータを差し引くことにより、サンプルデータを減算します。
   手記：熱不安定性配位子実験では、初期配位子の濃度はスキャンごとに減少しています。したがって、サンプルスキャン1からバッファスキャン1を差し引くのが理想的です。コカインによるバッファースキャンは、リガンド変換が進行しても目立った変化を起こさないことがわかったため、1回の熱不安定性リガンドバッファースキャンを使用して、熱不安定性リガンド結合データをすべて差し引くことができます。
4. ベースラインから減算されたサンプル電力データを熱容量に変換します。
   手記：変換には、生体分子の部分的な比体積が必要であり、これを推定することができます。

5. データ分析

1. 短い平衡化時間の熱不安定性リガンド結合熱容量データセットを、ベースライン、リガンド濃度、フォールディング、およびリガンド結合パラメーターの 1 つのセットでグローバルに適合させます。
2. 熱不安定性配位子変換の速度定数を計算するために、長い平衡化時間データセットに対してグローバル フィットを繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	ケムインペックス	#00829
リン酸ナトリウム一塩基性二水和物	シグマ・アルドリッチ	71502
リン酸二塩基性ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S9763
分子生物学のための脱イオン水	ミリポア	H20MB1001
0.2ミクロン滅菌シリンジフィルター	VWRの	CA28145-477
3 kDa遠心フィルター	ミリポア	UFC900324
透析チューブ 0.5-1.0 kDa カットオフ	スペクトラムラボラトリーズ	131048
シリコンチューブ	VWRの	89068-474
プラスチックDSCフランジキャップ	TAインスツルメンツ	6111
DNAアプタマーMN4	統合DNAテクノロジー	https://www.idtdna.com/site/order/menu
コカイン	シグマ・アルドリッチ	C008
キニーネ	シグマ・アルドリッチ	22620
NanoDSC-IIIマイクロカロリメーター	TAインスツルメンツ	http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRunソフトウェア	TAインスツルメンツ	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyzeソフトウェア	TAインスツルメンツ	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
コントラッド-70	VWRの	89233-152