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1. 競合結合アッセイのためのCXCL12、アッセイバッファー、およびジャーカット細胞の調製
- CXCL12AF647(20 μg/mL;材料および試薬の表を参照)のストック溶液を、凍結乾燥試薬(-80°C、暗所で保存)を0.01%(容量/容量)のポリソルベート20を添加した超純水に溶解して調製します。このストック溶液からのシングルユースアリコートは、光から保護して-80°Cで保存してください。
- 200 mL Hank's Balanced Salt Solution(HBSS、10x、フェノールレッドおよび重炭酸ナトリウムを含まない、最終濃度1x)に40 mL HEPES(1 M、20 mM最終濃度)を加えて、アッセイバッファーを調製します。超純水を加えて最終容量2Lを得る.4g(0.2%重量/容量)のウシ血清アルブミン(BSA)を加え、磁気攪拌によりBSAを溶解する。最後に、pHを7.4に調整し(これにはNaOHを使用)、真空マニホールドを使用して0.2μmの細孔(材料と試薬の表を参照)で溶液をろ過します
注:このアッセイバッファーは、プロトコルの以降のすべてのステップで使用されます。
- Jurkat細胞の数と生存率を数えます。このためには、細胞懸濁液のサンプルを採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈します
手記：私たちは、さまざまな濃度の細胞懸濁液をカウントできる自動細胞生存率アナライザー(材料および試薬の表を参照)を日常的に使用しています。細胞計数には、0.5 mLの細胞懸濁液を1.5 mL PBSで希釈します(1.9 mL PBSで0.1 mLなどの他の希釈も可能です)。細胞数と生存率をカウントするための他のいくつかのデバイスが市販されており、これらは同様にうまく機能するはずです。
- 必要な数の細胞(すなわち、1つの完全な96ウェルプレートでアッセイを実行するために24~106細胞)を滅菌済み50 mLチューブに回収し、400 x gでRTで5分間遠心分離します(使用する遠心分離機の種類については、材料および試薬の表を参照)。
- 細胞ペレットを乱さずに上清を静かに注ぎます。新鮮なアッセイバッファー(20 mLなど)を添加し、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞を再懸濁します。
- 細胞を再び400 x gでRTで5分間遠心分離します。
- 上清を再度注ぎ、細胞ペレットを新鮮なアッセイバッファーに再懸濁して、密度5 x 106細胞/mLを得ます。
>2. 競合結合アッセイ
>注:実際の競合結合アッセイはRTで実施され、非滅菌条件下で実施することができます。
- 調査中の化合物をアッセイバッファー(1.2を参照)で希釈して、目的の濃度を得ます。初期スクリーニング用に化合物の固定濃度(例:10 μM最終濃度)を調製するか、または化合物のより詳細な特性評価のための濃度の段階希釈シリーズ(例:1 μM、最終濃度の1 μMから始まる1/3、1/4、または1/5希釈シリーズ)を調製します。化合物溶液は最終的にアッセイで2倍に希釈されることに注意してください。したがって、2倍濃縮溶液を調製します。
- 100 μL の化合物溶液 (2x 濃縮) を透明な 96 ウェル丸底プレート (材料および試薬の表を参照) に、あらかじめ定義された実験レイアウト (図 1C など) に従って分注します。
注:この段階では、陰性および陽性の対照サンプルがアッセイに含まれています。ネガティブコントロールサンプルでは、化合物の代わりに100 μLのアッセイバッファーを96ウェルプレートのウェルに添加します。ポジティブコントロールサンプルの場合、このステップ中にアッセイバッファーも追加されます。図1Cは、複数の化合物の希釈シリーズを試験する典型的な実験レイアウトです。
- 試薬リザーバーから50 μLの細胞懸濁液(1.7、0.25 x 106細胞を参照)をマルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートに加えます。プレートを暗闇の室温で15分間インキュベートします。
- 蛍光標識されたCXCL12 50 μL (すなわち、アッセイバッファー中の 100 ng/mL の CXCL12AF647、4x 濃縮、最終濃度 25 ng/mL) を、同様の試薬リザーバーから 96 ウェルプレートのウェルまで加えます。暗闇の中でRTで30分間インキュベートします.
手記：ネガティブコントロールサンプルの場合は、代わりにアッセイバッファーを添加してください。したがって、ネガティブコントロールサンプルで検出された蛍光シグナルは、自己蛍光バックグラウンドシグナルに対応します(図1A)。ポジティブコントロールサンプルには、CXCL12AF647を50 μL/ウェル追加します。ポジティブコントロールサンプルは、化合物とのプレインキュベーションによる潜在的な阻害が含まれていなかったため、検出された最大の蛍光シグナルが得られます(図1A)。
- 96ウェルプレートを400 x gでRTで5分間遠心分離し、プレートを裏返してペレット化した細胞から上清を取り除きます。プレートをティッシュで乾かします。
- 試薬リザーバーから200 μLの新鮮なアッセイバッファーをマルチチャンネルピペットを使用してウェルに加えます。すぐに進めます。
- プレートをRTで400 x gで5分間再度遠心分離し、プレートを裏返して上清を取り除き、再度ティッシュで乾燥させます。
- PBSに溶解した1%パラホルムアルデヒドの200μLに細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。この手順では、セルを修正します。
- フローサイトメトリーによる蛍光の定量化により、直ちにプロトコールを続行します。
>3. フローサイトメトリーによるサンプルの解析
CXCL12AF647で染色および固定した細胞は、フローサイトメトリーを使用して分析する準備が整いました。フローサイトメーターにはいくつかの種類がありますが、励起に適したレーザー(赤色レーザー、励起範囲~630 nm)と蛍光色素検出に適したフィルター(蛍光フィルター~660 nm)を装備する必要があります。96ウェルプレート形式のサンプルを処理できる必要があります。適切なフローサイトメトリーデバイスの例は、材料および試薬の表に示されています。
- デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます(材料と試薬の表を参照)。
- ドットブロット形式で視覚化する細胞パラメータとして、前方散乱光(FSC)、側方散乱光(SSC)、および蛍光色素(CXCL12AF647)検出チャンネルを選択します。
手記： FSCパラメータでは、検出された光吸収がセルの直径に比例するため、セルはサイズに基づいて識別されます。SSCパラメータは、90°の角度で光散乱を測定し、細胞の粒度に関する情報を提供します。
- 1つのサンプル(例えば、ネガティブコントロールサンプル)を選択して、FSCおよびSSCパラメータに基づいて定義された均質な細胞集団のゲーティングを実行します。
- このネガティブコントロールサンプルから~100 μLの固定細胞をフローサイトメーターに自動注入します。注入前に「混合」オプションを選択し、1.5 μL/s のサンプル流速を使用します。
- 「Acquire Data」を選択してこのサンプルを実行します。このサンプルのFSCパラメータとSSCパラメータが画面に表示されます。
- ソフトウェアのゲーティングツールを選択します。FSCおよびSSCドットブロットの視覚化に基づいて、ゲーティングにより均質で生存可能な細胞集団を事前に定義します。これを行うには、これらの 2 つの次元に基づいて均一に分布した単一セル (「イベント」) を含むポリゴンを (ソフトウェアのゲーティング ツールを使用して) 作成します。
手記：ゲーティング手順は、さらなる分析に使用される均質で生存可能な細胞集団を定義することを目的としています。ゲーティングは、生存細胞の大部分がFSCおよびSSCパラメータに基づいて均質な細胞集団を形成するという仮定に依存しています。このステップを実行することにより、細胞破片、死細胞、および細胞凝集体をさらなる分析から大幅に除外できます。ゲート プロセスの図を図 1B に示します。
- サンプルあたり20,000の「イベント」(つまり、単一細胞)を分析する場合に選択します.
手記： これは、各サンプルについて、事前に定義されたゲート内にある20,000個の細胞が最終的に分析されることを意味します。各サンプルのデータ収集は、この数のイベントが分析されるまで続行されます。
- 実行を開始します(「データの記録」を選択します)。フローサイトメトリーデバイスは、各サンプルの平均蛍光強度(MFI)を記録することにより、すべてのサンプルを1つずつ分析します。このMFIは、事前に定義されたゲート内にある20,000個の細胞に対応する平均蛍光シグナルに対応します。
