BW細胞における受容体-リガンド相互作用を研究するためのELISAベースのレポーターアッセイ

要約

出典: Elias, S. et al., A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、レポーターアッセイに基づく受容体-リガンド相互作用の検出を示しています。受容体-リガンド相互作用が成功すると、下流のシグナル伝達経路が活性化され、溶液中の分泌レポーター分子としてサイトカインが生成され、放出されることがELISAで確認されています。

プロトコル

1. キメラコンストラクトを発現するプラスミドの生成

>注:目的は、マウスCD3ζ鎖の膜貫通ドメインと細胞内ドメインに融合した目的の受容体の細胞外ドメインを発現するプラスミドを生成することです(図1A)。

1. シグナルペプチドを含む目的の受容体の細胞外ドメインの配列を取得します。この受容体を発現すると予想されるDNA材料(cDNAやプラスミドなど)を入手します。
2. マウスCD3ζ鎖の膜貫通および細胞内ドメインを発現するDNA材料(cDNAやプラスミドなど)を入手します。
3. 図1Aに示す一般的な構造に基づいて融合タンパク質の配列を設計します。シーケンス全体が同じコドン読み取りフレーム内にあることを確認してください。この配列は、適切なプライマーを設計し、最終製品を検証するために使用されます。
4. 融合タンパク質の各フラグメントを別々に増幅するための2つのPCR反応を設計します(図1B、1C).
   手記： PCR反応の特異的な条件(伸長時間やアニーリング温度など)は、特定の受容体用に設計されたプライマーの性質によって異なります。
   1. 受容体の細胞外セグメントを増幅します。
      1. 受容体のシグナルペプチドの一部、Kozakコンセンサス配列、および適切な制限部位を含む5'プライマーを設計します(図1B)。
      2. 融合タンパク質の両部分に隣接する3'プライマーを設計します(図1B)。例えば、初期設計では、この3'プライマーは、受容体の細胞外セグメントの最後の20塩基対とCD3ζセグメントの最初の9塩基対を含むことができる
         手記： このプライマーは融合配列の生成に使用され、ライゲーションには使用されないため、3'プライマーに制限部位を追加する必要はありません。
   2. CD3ζセグメントを増幅します。
      1. 融合タンパク質の両方の部分に隣接する5フィートプライマーを設計します(図1C)。例えば、初期設計の場合、5'プライマーは、受容体の細胞外セグメントの最後の9塩基対とCD3ζセグメントの最初の20塩基対を含むことができる
         手記：このプライマーは融合配列の生成に使用され、ライゲーションには使用されないため、5'プライマーに制限部位を追加する必要はありません。
      2. CD3ζ配列の末端と適切な制限部位を含む3'プライマーを設計します(図1C)。
   3. これら2つの反応のそれぞれのプライマー配列を修正して、アニーリング温度が各ペアで類似するようにします(融合タンパク質の2つの部分の配列を含むプライマーは、各反応の配列の一部とのみアニーリングすることに注意してください)。
5. 最初の2つの反応のPCR産物の混合物をDNAテンプレートとして、細胞外受容体セグメントの5'プライマー(ステップ1.4.1.1)およびCD3ζセグメントの3'(ステップ1.4.2.2)(図1D)を含む追加のPCRを実行します。この反応により、最終的な融合配列が生成されます。
6. クローニングは通常どおり続行します。
   1. 最終 PCR 産物をターゲットカットベクターにライゲーションします (ターゲットベクターは通常、G418 およびアンピシリン耐性を発現する pcDNA3 です)。
   2. ライゲーションされたベクターをコンピテントバクテリアに変換します。
      1. 50 μLのコンピテントバクテリアを氷上で解凍します。
      2. ライゲーションされたベクターをバクテリアに加え、氷上で20分間インキュベー
      トします。
      3. 42°Cで45秒間インキュベートします。
      4. 抗生物質を含まないLB200μLを添加します。
      5. 連続振とうしながら、37°Cで1時間インキュベートします。
      6. 適切な抗生物質(例:最終濃度0.1 mg / mLのアンピシリン溶液)を含むLBプレートに播種します。
   3. 5 mLのLB(15 mLチューブ内)にいくつかの細菌コロニーを収集して増殖させます。
   4. 翌日、ミニプレップキットでプラスミドを抽出します。
   5. 制限酵素で遺伝子インサートを解析します。
   6. 関連するコロニーをシーケンシングし、シーケンシングとリーディングフレームが正しいことを確認します(ステップ1.3を参照)。
7. 検証されたプラスミドをコンピテントバクテリアに変換します。
   1. 20 μLのコンピテントバクテリアを氷上で解凍します。
   2. プラスミド1μLをバクテリアに加え、氷上で20分間インキュベー
   トします。
   3. 42°Cで45秒間インキュベートします。
   4. 抗生物質を含まないLB200μLを添加します。
   5. 連続振とうしながら、37°Cで1時間インキュベートします。
   6. 適切な抗生物質(例:最終濃度0.1 mg / mLのアンピシリン溶液)を含む細菌増殖プレートに播種します。
8. 翌日、0.1 mg/mL アンピシリン (~250 mL) を含む大きな LB 容器で細菌コロニーを増殖させます。
9. 翌日、キットに記載されている特定の指示に従ってマキシプレップを実行します
   手記：エレクトロポレーション手順では、以下に詳述するように、大量のプラスミドが必要です。

2. キメラタンパク質を発現するプラスミドのBW細胞へのトランスフェクション

>注:トランスフェクションには、さまざまな方法(レンチウイルス感染など)も使用できます。エレクトロポレーションに先立ち、以下に説明するようにDNAのエタノール沈殿を行います。次のステップでは、無菌状態が必要です。

1. 前日に、エレクトロポレーション用のBW5147セル(「BWセル」)を準備します。10 mL の 10 mL の 100,000 BW5147 細胞/mL (つまり、合計 10 x 10⁶ 細胞) を 10 mL のプレート (10 cm から) に RPMI を添加し、10% の子牛胎児血清 (FCS)、1% ピルビン酸ナトリウム、1% L-グルタミン、1% 非必須アミノ酸、1% ペニシリン - ストレプトマイシン (「完全培地」) を補充します。
2. 融合タンパク質を発現するpcDNA3プラスミド100 μgを1.5-2 mLチューブに入れ、pH 5.3-5.5の3 M酢酸ナトリウムを添加します。酢酸ナトリウムの容量は、100μgプラスミドの容量の0.1(10%)に対応する必要があります。酢酸ナトリウムのpHをpHメーターでNaOHまたはHClを添加して滴定します。
3. ステップ2.2で説明したように、プラスミドと酢酸ナトリウムの混合物に2.5容量の100%エタノールを加えます(プラスミドと酢酸ナトリウムの総容量の2.5倍)。-20°Cで一晩または70°Cで2時間インキュベートします。
4. BW細胞を播種してから24時間後、すべてのBW細胞(~100mL)を2本の50mLチューブに集めます。細胞を515 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
5. 両方のチューブからペレットを25 mLのRPMI-に1本の50 mLチューブに再懸濁します。.例えば、1つのチューブのペレットを25mLのRPMI-で再懸濁し、次にこの液体を使用して他の50mLチューブの液体を再懸濁し、BW細胞からの総ペレットが1本のチューブ内の25mLの培地に再懸濁されるようにします
   手記：培地は、血清がエレクトロポレーションを妨げる可能性があるため、追加しないでください。.
6. 細胞を515 x gで5分間再度遠心分離します。ペレットを1mLのRPMIに再懸濁し、内容物を氷上の0.4cmキュベットに移します。
7. エタノール沈殿(ステップ2.3)したプラスミドを、16,000 x g、4°Cで30分間遠心分離します。
8. 1 mLの70%エタノールで1回洗浄し、16,000 x g、4°Cでさらに20分間遠心分離します(塩分を洗い流すため)。
9. すべてのエタノールを取り除き、ペレットを少し乾かします(つまり、組織培養フードの開いたチューブ内)。ペレットを100μLのRPMI-で再懸濁します-以前に60°Cに加熱します。
10. 再懸濁したプラスミド(ステップ2.8)をキュベット内の細胞に加え、氷上で5分間インキュベートします。
11. 0.23 kV、250容量でセルをエレクトロポレーションします。これには ~4 ミリ秒かかります。
12. エレクトロポレーションした細胞を50 mLチューブに移し、50 mLの完全培地を加え、5.15 x gで5分間遠心分離します。
13. 上清を捨て、50 mLの完全培地で細胞を再懸濁します。
14. エレクトロポレーション細胞を24ウェル培養皿(1ウェルあたり1 mL、合計~50ウェル)に播種し、37°Cおよび5% CO₂で48時間インキュベー
トします。
15. 抗生物質でトランスフェクションした細胞を選択します。48時間後、10 mg/mL G418を添加した1 mLの完全培地を各ウェルに加えます(この段階では、各ウェルの最終容量は2 mLで、各ウェルのG418の最終濃度は5 mg/mLです)
    mL 手記：プラスミドに異なる抗生物質耐性が含まれている場合は、このステップの前に、トランスフェクションされていないBW細胞を死滅させるために必要な抗生物質濃度を決定してください。
16. 48時間ごとに、ウェル内の培地を攪拌せずに、各ウェルの上部容量の1 mLを慎重に廃棄します(BW細胞はウェルの底にある傾向があります)。5 mg/mL G418 を添加した全培地を各ウェルに加え、各ウェルの最終容量が再び 2 mL になるようにします。
17. すべてのウェルで培養プレートの細胞増殖を定期的に調べてください.
    手記：培地の色を黄色に変更すると、成長している細胞を特定するのに役立つ場合があります。しかし、最初はG418自体のせいでミディアムは黄色になります。ポジティブウェル(細胞が増殖しているウェル)を特定します。これらのウェルはG418耐性があるため、融合タンパク質を発現することが期待されます。このプロセスには通常~3週間かかります。

3. 陽性ウェルの細胞におけるトランスフェクトされた受容体の発現の検証。

1. トランスフェクションしたBW細胞を、トランスフェクションした受容体に対する特異的抗体で染色します。
2. フローサイトメトリーによる受容体の発現レベルを、コントロール細胞(トランスフェクションされていないBW細胞)の発現と比較します。
3. 1つ以上のウェルを確認した後、細胞を直ちに実験目的で使用するか、培養で増殖させるか、将来のアプリケーションのために凍結します。
4. 新しい実験を行う前に、トランスフェクションされた受容体の発現を確認してください。増殖の数週間後、安定した受容体発現を有するG418を有する細胞は、G418を培地から省略することができる。

4. トランスフェクションされたBW細胞とターゲットのインキュベーション

>注:トランスフェクションされたBW細胞を初めて使用するときは、目的の受容体の既知のリガンドを発現するターゲット、または目的の受容体に対して特異的に向けられたプレート結合抗体でそれらをテストすることが望ましいです(架橋実験;以下のセクション4.2.1.3を参照)。

1. 好ましくは、実験の24時間前にBW細胞を分割する(例えば、新しい10cm培養プレートに培養中の細胞10mLに10mLの完全培地を添加する)。
2. トランスフェクションしたBW細胞をそのターゲットとインキュベートします。空のベクターを発現する制御BW細胞(または親BW細胞)で実験を同時に実行します。96Fプレートが好ましい(ただし、96Uプレートも使用できる)。実験を3回で行います。完全な培地中のすべての細胞を懸濁します。
   1. ターゲットを準備します。ターゲットの種類は、目的の関数によって異なり、細胞、抗体と事前にインキュベートされた細胞、または抗体のみの場合があります。このシステムは、細菌を標的としても使用されています。
      1. ターゲットが分裂している細胞(すなわち、細胞株)である場合は、アッセイの前に6,000 radで照射してください。50,000個のターゲット細胞を96プレートの1つのウェル(容量100 μL)に入れます。
      2. 抗体およびヒトFcγRsを発現するBW細胞を用いた実験では、96ウェルプレート(例えば、標的細胞50 μLと抗体50 μL)で、標的細胞を抗体と氷上でインキュベートします(例えば、標的細胞50 μLと抗体50 μL;異なる抗体用量を試験できます)。
      3. 抗体を単独でターゲットとして使用する場合(架橋実験)は、プレートに結合させる必要があります。この目的のために、まず、抗体を96Fプレート内の完全培地で37°Cおよび5%_CO2で1〜2時間インキュベートします(一般的な開始用量は50μL中の0.5μgの特異的抗体です)。プレートを洗浄して、結合していない抗体を除去します.
         手記：この場合、96Fプレートは抗体のプレートへの結合を可能にし、トランスフェクションされたBW細胞の添加後、トランスフェクションされた受容体の活性化につながります。
   2. BW細胞(エフェクター細胞)を追加します。50,000 BW細胞を96プレート(容量100 μL)の1つのウェルに入れます。
   3. 必要に応じて、各ウェルの容量を200 μLまで完成させます。
   4. プレートを37°Cおよび5%CO₂で48時間インキュベートします(この時間は校正できます)。
3. 48時間後、プレートを-20°Cで凍結して解凍してからELISAにするか、すぐにELISAに使用します(次のステップを参照)。

5. ELISAの

1. ELISAプレートに抗マウスIL-2抗体(抗mIL-2)をコーティングします。0.05 μgの抗mIL-2を、ウェルあたり1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)50 μLの容量に入れます。コーティングしたELISAプレートを抗mIL-2抗体と4°Cで一晩、または37°Cで2時間
   インキュベートします。 手記：インキュベーションステップの直後にELISAを実行するには、BW細胞のインキュベーション期間が終了する24時間前にELISAプレートをコーティングする必要があります。
2. ELISAプレート内の液体を廃棄し、1x PBSと1%ウシ血清アルブミン(BSA)で構成されるブロッキング溶液(ウェルあたり200 μL)を追加します。ELISAプレートを室温で2時間インキュベートします。
3. 0.05% PBS Tween 溶液 (つまり、1x PBS 1 リットルに 0.5 mL の Tween-20) で ELISA プレートを 3 回洗浄します。
96プレートには、
4. ターゲット(4.3)とインキュベートされたBW細胞があります。プレートが凍結している場合は、完全に解凍します(たとえば、37°Cで短時間インキュベートします)。96ウェルプレート(5分、515 x g)を遠心分離し、各ウェル中の上清100 μLをプレコートしてブロックしたELISAプレートに慎重に移します><。 手記：上清は、細胞が採取されるのを避けるために、各ウェルの側面から収集する必要があります。
5. 必要に応じて、コーティングされたELISAプレートの空の行の1つに、定義された濃度の組換えmIL-2を添加して、mIL-2の標準曲線を生成します。例えば、mIL-2 濃度が 2,500 pg/mL から開始し、その後の各ウェルで 50% ずつ減少させます。最後のウェルにmIL-2を添加しないでください。
6. ELISAプレートを4°Cで一晩、または37°Cで2時間インキュベー
トします。
7. ELISAプレートをPBS Tweenで4回洗浄します。
8. ビオチン抗マウスIL-2をELISAプレートに添加します。1% BSAを含む1x PBSの1 mLに1 μgの抗体を1 mL溶かし、ウェルあたり100 μLに分割します。
9. 室温で1時間インキュベートします。
10. ELISAプレートをPBS Tweenで6回洗浄します。
11. HRP標識ストレプトアビジンを添加します。1% BSA含有PBSX1 1 mLに1 μLのストレプトアビジンを1 mL使用し、ウェルあたり100 μLに分割します。
12. 室温で30分間インキュベートします。
13. ELISAプレートをPBS Tweenで6回洗浄します。
14. TMB基質溶液のウェルあたり100μLを添加します。TMBを追加する際のタイムラグによるウェル間の差を最小限に抑えるために、このステージを迅速に完了します。
15. ELISAプレートリーダーで650nmのELISAプレートを読み取ります(信号が弱い場合は読み取りを繰り返すことができます)。

結果

図1:キメラ受容体-CD3ζの構造とPCRプライマーの設計。(A)マウスCD3ζの膜貫通ドメインと細胞内ドメインに融合した細胞外受容体の一般的な構造。(B)受容体の細胞外ドメインは、CD3ζのヌクレオチドも含む3'プライマーで増幅した。(C)CD3ζの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを、受容体ヌクレオチドを含む5'プライマーで増幅した。(D)最終的なPCR反応では、配列が重複する両方のセグメントをDNAテンプレートとして使用しました。すべての図パネルでは、異なるタンパク質ドメインが色分けされ、青い長方形(CD3ζ配列)と赤い長方形(受容体配列)で囲まれています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AccuPrep、プラスミドミニ抽出キット	バイオニア	品番K-3030
抗マウスIL-2	バイオレジェンド	503702
ビオチン抗マウスIL-2	バイオレジェンド	503804
ELISAプレート	デグルート	60-655061
ウシ胎児血清	シグマ	F7524-500ミリリットル
G418	水銀	MBS3458105GM
ジーンパルサーII	バイオ・ラッド	165-2105、165-2106、165-2107、165-2108、165-2109、165-2110
L-グルタミン	バイオ産業	03-020-1B
MEM非必須アミノ酸溶液	バイオ産業	01-340-1B
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液	バイオ産業	03-031-1B(ゼロ)
ペルオキシダーゼストレプトアビジン	ジャクソン免疫研究	016-030-084
PureLink HiPure プラスミドフィルター Maxiprep キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	K210016
RPMI-1640 ミディア	バイオ産業	2001年30月
ピルビン酸ナトリウム	バイオ産業	03-042-1B
TMBの	サザンビオテック	0410-01

の (代表) ム