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1. ヒト赤血球の単離、ビオチン化、浸透圧の調整
>注:ステップ1.1は、看護師などの訓練を受けた医療専門家が、治験審査委員会が承認したプロトコルを使用して実行する必要があります。
- 指の刺し傷から8-10 μl(1滴)の血液を採取し、炭酸塩/重炭酸塩緩衝液1 mlに加えます(材料リスト)。混合物を穏やかにボルテックスまたはピペットで渦巻き、900 x gで1分間遠心分離します。上澄みを捨てて、もう一度洗います。
- 小さなビーカーに3.5〜4mgのビオチン-PEG3500-NHSリンカーを秤量します(材料リスト)。炭酸塩/重炭酸塩緩衝液に溶解して、最終濃度を3 mg / mlにします。
- 炭酸塩/重炭酸塩緩衝液171 μl、RBCパック10 μl、およびビオチン-PEG3500-NHSリンカー溶液1049 μlを混合し、室温で30分間インキュベートします。RBCを炭酸塩/重炭酸塩緩衝液で1回洗浄し、次にN2-5%緩衝液で2回洗浄します(材料リスト)。
- その間、キャップを緩めたリンカーボトルを、デシカントを充填したガラス製の真空デシケーターに底に置き、5分間真空にし、デシケーターにアルゴンを充填します。キャップを締めてボトルを取り出します。ボトルをプラスチックパラフィンフィルム(材料リスト)で密封し、底に乾燥剤を充填した容器に入れ、-20°C.
で保管します
手記：1.2-1.4を含むビオチン-PEG3500-NHSリンカーの使用を含むステップ(1.3でのインキュベーションと洗浄を除く)は、できるだけ早く実行する必要があります。
- ナイスタチンをN2-5%緩衝液に希釈して最終濃度40 μg/mlにしてください。ビオチン化赤血球5 μlを71.4 μlのナイスタチン溶液と混合し、0°Cで1時間インキュベートします。N2-5%緩衝液で2回洗浄し、N2-5%緩衝液+ 0.5% BSA(材料リスト)で冷蔵庫(4°C)で保存してください。
2. ガラスビーズのシラン化
- ビード表面のクリーニング
- ガラスビーズ粉末50 mgを秤量し、500 μlのDI水に再懸濁します。
- 0.5 mlのビーカーで0.5 mlの30%H2O2(材料リスト)を9.5 mlのDI水と混合し、次に2 mlの濃縮NH4OH(材料リスト)を加え、この溶液をホットプレートのボイラーに持って行きます。
- 沸騰した溶液にガラスビーズを加え、さらに5分間沸騰させ続けます。
- 煮沸後、この高温ビーズ懸濁液を~5 mL の 15 ml マイクロ遠心チューブに移し、RT DI 水を補充します。3,500 x gで5分間遠心分離し、上清を除去して廃棄します。
- さらに5 mlのホットビーズ懸濁液を移し、洗浄したビーズに加え、さらにDI水を補充し、よく混ぜて、再度遠心分離します。この手順を約50mlのDI水を使用するまで繰り返し、合計4〜5回の洗浄になります。
- ビーズ懸濁液を1mlのバイアルに移します。ビーズをメタノール(材料リスト)で17,000 x gで5分間3回遠心分離して洗浄を繰り返し、最後にビーズを100%メタノール1mlに再懸濁します。
- ビーズ表面チオロール
- 50 mLの遠心チューブに、メタノール45.6 mL、酢酸0.4 mL(材料リスト)、脱イオン水1.85 mL、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTMS)1.15 mL(材料リスト)、2.1で調製したビーズ懸濁液1 mLを加え、室温で3時間インキュベートします。
- 反応後、新鮮なメタノールで一度洗浄してすべての反応物を取り除き、ビーズを500μlのメタノールに再懸濁します。この濃縮ガラスビーズ懸濁液を、スクリューキャップ付きの乾燥した清潔なガラスバイアル20個に均等に分けます。乾燥アルゴンのジェットを使用してメタノールを蒸発させ、バイアルをゆっくりと回転させて、各バイアルの側面に乾燥ビーズの薄い層を作ります。
- ビーズのバイアルを120°Cに予熱した乾燥オーブンに5分間入れてから取り出し、キャップを緩めてすばやく置きます。底に乾燥剤を充填したガラス製の真空デシケーターにバイアルを置き、冷却されるまで真空ポンプでデシケーターを真空ポンプで真空にします。
- 真空引きしたデシケーターを乾燥アルゴンでパージして、デシケーターを通常の大気圧に戻します。デシケーターの蓋を取り外し、バイアルのキャップをすばやく締め直します。バイアルをプラスチックパラフィンフィルムで密封し、RTで乾燥した暗い保存箱に保管します。
- すぐに使用する場合は、ドライビーズのバイアル1本を取り、リン酸緩衝液(材料リスト)で1回洗浄し、50μlのリン酸緩衝液に再懸濁し、4°Cで保存します。この濃縮ビーズ調製物は、次の手順で「MPTMSビーズ」と呼びます.
手記：適切に保管すれば、MPTMSビーズは最大3ヶ月間機能し続けることができます。
3. ビーズの機能化
- ビーズ上のタンパク質を共有結合的にコーティング
- 一定量のタンパク質ストック(2.5 μlなど)を取り出し、等量の炭酸塩/重炭酸塩緩衝液と混合して溶液1.
手記：容量は、ストック濃度とビーズ表面上のタンパク質の望ましい最終部位密度に依存します。
- 小さなビーカーで2〜3 mgのMAL-PEG3500-NHSリンカー(材料リスト)を秤量し、炭酸塩/重炭酸塩緩衝液で溶解して最終濃度0.231 mg / mlにします。
- 溶液1を、3.1.2で調製したリンカー溶液と等量を混合します。混合物を室温で30分間インキュベートし、溶液2を作ります。
- その間、キャップを緩めたリンカーボトルを、デシカントを充填したガラス製の真空デシケーターに底に置き、5分間真空にし、デシケーターにアルゴンを充填します。キャップを締めてボトルを取り出します。ボトルをプラスチックパラフィンフィルムで密封し、底に乾燥剤を充填した容器に入れ、-20°C.
で保存します。
手記：3.1.2-3.1.4を含むMAL-PEG3500-NHSリンカーの使用を含むステップ(3.1.3のインキュベーションを除く)は、できるだけ早く完了する必要があります。
- 5 μlのMPTMSビーズをSolution 2と混合し、リン酸緩衝液(材料リスト)を加えて最終容量250 μlにします。
- ビーズを室温で一晩インキュベートし、リン酸緩衝液で3回洗浄し、100 μlのリン酸緩衝液に再懸濁し、4°Cで保存します。
- タンパク質/ストレプトアビジン(SA)コーティングビーズの調製
- プロトコル3.1.1-3.1.4に従います。
- 5 μlのMPTMSビーズをSolution 2と5 μlの4 mg/mlストレプトアビジン-マレイミド(SA-MAL)(材料リスト)溶液に混合し、リン酸緩衝液を添加して最終容量250 μlにします。
- ビーズを室温で一晩インキュベートし、リン酸緩衝液で3回洗浄し、最後に100 μlのリン酸緩衝液に再懸濁して4°Cで保存します。
- ガラスビーズへのストレプトアビジンのコーティング
- 5 μlのMPTMSビーズを5 μlの4 mg/ml SA溶液と混合し、140 μlのリン酸緩衝液を加えます。
- ビーズを室温で一晩インキュベートし、リン酸緩衝液で3回洗浄し、50 μlのリン酸緩衝液に再懸濁し、4°Cで保存します。
- SAコーティングビーズのビオチン化タンパク質によるコーティング
- 5 μlのSAコーティングビーズをタンパク質 (容量は所望のコーティング密度によります) と混合し、リン酸緩衝液を添加して最終容量を100 μlにします。
- 混合物を4°Cで一晩または室温で3時間インキュベートし、リン酸緩衝液で3回洗浄し、50 μLのリン酸緩衝液に再懸濁して4°Cで保存します。
4. 細胞の準備
>注:細胞を精製するには、使用中の細胞の種類、たとえばT細胞や特定の細胞株に対応する標準的な細胞精製プロトコルに従ってください。
- fBFP実験では、細胞懸濁液を調製した後、DMSOに溶解したFura2-AM(Material list)を細胞懸濁液に加えて最終濃度2 μMにし、室温で30分間インキュベートした後、一度洗浄します。この蛍光を充填した細胞懸濁液は、使用するまで暗所に保管してください。
5. マイクロピペットとセルチャンバーの準備
- マイクロピペットの準備
- 長い毛細管ガラス管(材料リスト)をガラスカッターで長さ約3インチの短い部分に切断します。マイクロピペットプーラー(材料リスト)に1個を取り付け、「プル」ボタンをクリックすると、キャピラリーの中央が機械によって加熱され、キャピラリーが両端で引っ張られて、先端が尖った2つのキャピラリー(生のマイクロピペット)が作成されます
手記：製品ガイドラインに従うことにより、生ピペットの所望の形態は、6-8mmのテーパーと0.1-0.5μmの先端を有する。
- マイクロピペットフォージのピペットホルダーに生のピペットを取り付けます(材料リスト)。鍛造品のガラス球を溶かすための熱。生のピペットの先端をガラス球の内側に挿入します。ガラス球を冷まし、生のピペットを引っ張って外側から壊し、先端を球体の内側に残します。目的の先端オリフィスが得られるまでこの手順を繰り返します.
手記： マイクロピペットチップの内径の例:RBCの場合は2.0〜2.4μm、ビーズの場合は~1.5μm、T細胞の場合は~2〜4μm、ハイブリドーマ細胞の場合は-7μm。
- 細胞室の構築
注:セルチャンバーは、2つの金属正方形(銅/アルミニウム)とそれらをリンクするハンドルで構成される自家製のチャンバーホルダーに基づいて構築されています(図1D)。
- 40 mm x 22 mm x 0.2 mm のカバーガラスをガラスカッターで 40 mm x 11 mm x 0.2 mm の 2 枚 (カバースリップ 1 と 2) にカットします。カバースリップ1をグリースでチャンバーホルダーの上面に接着し、2つの金属の正方形を橋渡しするように接着し、同様にカバースリップ2を下面に接着すると、平行カバースリップセルチャンバーが形成されます(図1D)。
- ピペットを使用して、2つのカバースリップの間に200 μlの実験バッファーを注入します。バッファが両方のカバースリップに取り付けられていることを確認してください。チャンバーをゆっくりと回転させて振とうし、バッファーがチャンバーの両端に触れるようにします。
- 実験用緩衝帯に隣接するチャンバーの両側に鉱油を慎重に注入し、それによって緩衝液を外気から密閉します。プローブビーズ(例えば、pMHC被覆ビーズ)、RBC、およびターゲット(例えば、T細胞)の懸濁液を、それぞれ緩衝ゾーンの上部、中部、および下部領域に注入します。
4. BFP実験
- 顕微鏡(材料リスト)と光源の電源を入れます。チャンバーをメイン顕微鏡ステージに置きます(図1A、D)。
- BFPの3つのマイクロピペットをすべて取り付けます(図1D。左:プローブ、RBCをつかむため、右:ターゲット、細胞またはビーズをつかむため、右下:ヘルパー、ビーズをつかむため)。
- マイクロインジェクター(材料リスト)を使用して、マイクロピペットに実験用バッファーを埋め戻します。ピペットホルダー(材料リスト)を取り外し、先端から水が滴り落ちるように下の位置に保持します。マイクロピペットをホルダーチップにすばやく挿入し、挿入中にマイクロピペットに気泡が入らないことを確認します。ホルダーのネジを締めます。
- 各ピペットホルダーを対応するマイクロマニピュレーターに取り付けます。マイクロピペットをチャンバーに向かって押し、先端がチャンバーバッファー領域に入るようにします。マイクロピペットの位置を調整し、顕微鏡の視野内でマイクロピペットを見つけます。
- チャンバーホルダーステージを動き回って、3つの要素(RBC、ターゲット、プローブビーズ)のコロニーを1つずつ見つけます。マニピュレーターのノブを回して、マイクロピペットの先端が1つの細胞/ビーズに近づくようにして、対応するマイクロピペットの位置を調整します。対応するマイクロピペット内の圧力を調整して、細胞/ビーズを吸引します。3つのマイクロピペットはすべて、対応する要素を捕捉します。
- チャンバーホルダーステージ内を移動して、注入された要素のコロニーから離れた実験が行われるオープンスペースを見つけます。顕微鏡の視覚モードを切り替えて、コンピューター画面上のコンピュータープログラム上の画像を視覚化します。ピペットチップの3つの要素すべてをプログラムの視野に移動します。
- プローブビーズとRBCを位置合わせし、プローブビーズをRBCの頂点に慎重に操作し、ビーズをRBCに短時間衝突させて静かに引っ込めます。ヘルパーマイクロピペットの圧力を調整してビーズをそっと吹き飛ばし、RBCの頂点に接着したままにします(図1F)。ヘルパーマイクロピペットを離し、ターゲットとプローブビーズの位置を合わせます(図2A)。
- プログラムでは、ビジョンフィールドウィンドウで、プログラム内のツールを使用して、プローブマイクロピペット(Rp)のそれぞれの半径、RBC(R0)、RBCとプローブビーズ(Rc)との間の円形接触領域を測定し、RBC(k)のばね定数を次の式で推定できます(Δpはプローブピペット先端の吸引圧力)。注:フックの法則から、結合力Fは、プローブビーズのばね定数と変位(d)の積、つまりF = d(図2C)によって定量化できます
- プログラムに目的のRBCスプリング定数を入力します(プロトコルセクション4.6を参照してください。ばね定数は通常、フォースクランプアッセイと接着周波数アッセイでは0.25または0.3 pN / nm、熱変動アッセイでは0.1 pN / nmに設定されています)これにより、必要な吸引圧力が1センチメートルの水で返されます。必要な吸引圧力に達するまで、プローブのピペットにリンクする水タンクの高さを調整します。
- RBCの頂点を横切る水平線を引くと、この線に沿った各ピクセルの明るさ(グレースケール値)を示す曲線が隣接するウィンドウに作成されます。しきい値線をドラッグして、曲線の深さの約半分になるようにします (図 2A、B).
手記：しきい値線より下の輝度曲線上の最小点は、ビード境界の位置を示すため、1つのローカル最小値のみが許可されます。2つ以上の局所最小値が存在する場合は、画像が最適ではないことを示しています(画像の焦点が合っていないか、プローブビーズとRBCの間の位置合わせが不十分である可能性があります)。
- 目的の実験モード(熱変動アッセイ、接着頻度アッセイ、またはフォースクランプアッセイ)を選択します。必要に応じてパラメータを設定します(例:インピンジメント力=15pN、負荷率=1,000pN/s、接触時間=1秒、クランプ力=20pN(フォースクランプアッセイ用)など)。
- 「開始」をクリックすると、プログラムはターゲットピペットを動かし、ターゲットをプローブに接触させたり離したりすることができます(詳細については、代表的な結果のセクションを参照)。データ収集は並行して行われ、プローブビーズの位置がリアルタイムで記録されます。「実験の停止」ボタンをクリックしてプログラムを停止すると、取得したデータを保存するためのウィンドウが表示されます。
