競合するGTPase結合タンパク質パートナーを研究するための競合結合アッセイ

要約

出典:Williamson, R. C., et al. Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、GTPase結合タンパク質パートナーを研究するための競合アッセイを実演しています。磁気ビーズに固定化されたヌクレオチド結合GTPaseタンパク質を利用すると、GTPase上の同じ結合部位に対する2つの相互作用タンパク質パートナー間の競合的結合を研究し、タンパク質パートナーの結合親和性を評価することができます。

プロトコル

1. GSTタグ付きGTPaseの精製

1. 500 mLの自己誘導培地(25 mM Na₂HPO₄、25 mM KH₂PO₄、50 mM NH₄Cl、5 mM Na₂SO₄、2 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、 0.5%グリセロール、0.05%グルコース、0.2%ラクトース、5 gトリプトン、2.5 g酵母抽出物、100 μg/mlアンピシリン)。
2. 10,000 x g、4°Cで10分間遠心分離することにより、細菌を回収します。
3. 細菌ペレットを20 mLのタンパク質抽出試薬、1xプロテアーゼ阻害剤に再懸濁し、RTで20分間インキュベートし、反転させます。
4. ライセートを40,000 x gで30分間遠心分離して清澄化します。
5. リン酸緩衝生理食塩水(PBS:10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、2.7 mM KCl)で洗浄した2 mLのグルタチオン磁気ビーズを加えます。
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6. 時間インキュベートし、4°Cで反転して混合します。
7. タンパク質を充填したビーズを10 mLのPBSで4回洗浄し、磁性粒子選別機を使用して各ステップでビーズを沈殿させます。
8. タンパク質をロードしたビーズを2 mLのPBSに再懸濁し、必要になるまで100 μlのアリコートで-80°Cで保存してください。

2. GTPase結合タンパク質の発現

1. 実験の前日に、以下のようにして、各GTPase結合タンパク質の緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きバージョンをコードするプラスミドを別々の75 cm² HEK293Tフラスコにトランスフェクションします。ヌクレオチドローディングを検証するには、GFPタグ付きTrioD1を3つ目の75 cm²フラスコHEK293Tにトランスフェクションします。
   1. ポリエチレンアミンを100 μlの滅菌済み150 mM NaCl溶液中で1 mg/mLに希釈します。
   2. 希釈したポリエチレン27 μLを、還元した血清培地223 μLに加えます。
   3. 12 μgのプラスミドDNAを250 μlの減量血清培地に添加します。
   4. 各チューブを室温で2分間インキュベートします。
   5. ポリエチレンアミンとDNAの混合物を1本のチューブで混合し、2分間ボルテックスします。
   6. 室温で15〜20分間インキュベートします。
   7. 90%コンフルエントHEK293Tの増殖培地(Dulbecco's Modified Eagle Media、10%ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、抗生物質なし)を5 mLの新鮮増殖培地と交換します。
   8. 結合したポリエチレン/DNA混合物をフラスコに加え、O/Nを37°C、5%CO₂でインキュベートします。

3. GTPase結合タンパク質の精製

1. トランスフェクションした細胞のフラスコをPBSですすぎ、フラスコを5分間排出し、遊離液を吸引します。
2. 500 μLの溶解バッファー (50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、1% Nonidet P-40、1x protease inhibitor) 中の細胞をマイクロフュージチューブに掻き取ります。
3. 4°Cで30分間反転して混合することにより、細胞を溶解します。
4. 溶解中に、2ロットの40 μLのGFP-Trapビーズを新鮮な溶解バッファーで3回洗浄し、2,700 x gでビーズを沈降させます。
5. ライセートを21,000 x gで10分間遠心分離して清澄化します。
6. 各競合タンパク質の清澄化ライセートを洗浄したGFPトラップビーズを分離し、GFP融合タンパク質を2時間結合させ、4°Cで反転して混合します。
7. GFP-Trapビーズを50 mM Tris-HCl(pH 7.8)、50 mM NaCl、0.7%(w/v)Nonidet P-40に2回、50 mM Tris-HCl(pH 7.6)、20 mM MgCl₂に2回、2,700 x gで2分間沈降させるGFP-Trap
ビーズを洗浄します。
8. 40 μl の 0.2 M グリシン (pH 2.5) を添加し、30 秒間ピペッティングして GFP 融合タンパク質を溶出します。直ちに 21,000 x g で 60 秒間沈殿させ、4 μl の 1 M Tris-HCl (pH 10.4) が入った新しいマイクロチューブに液体を移します。精製されたタンパク質への損傷を制限するために、これを迅速に行ってください。
9. 精製した各タンパク質1 μlをウェスタンブロットで分析し、抗GFP抗体でプローブし、メーカーのプロトコールに従って定量的ブロッティングシステムを使用して相対収量を確立します。あるいは、ビシンコニン酸(BCA)アッセイでタンパク質濃度を決定しますが、タンパク質がアッセイと同一の方法で反応しない場合、または汚染物質タンパク質がある場合、エラーが発生します。
10. 50 mM Tris-HCl(pH 7.6)と20 mM MgCl₂を添加して、モルタンパク質濃度を均等化します。

4. GTPaseのヌクレオチド負荷

1. ステップ1で調製したGST-Rac1磁気ビーズの1アリコートを解凍します。
2. 90 μlのGST-Rac1ビーズを、磁性粒子ソーターを使用して20 mM Tris-HCl (pH 7.6)、25 mM NaCl、0.1 mM DTT、および4 mM EDTAで3回洗浄し、各ステップでビーズを沈殿させます。
3. ビーズからバッファーを吸引し、20 mM Tris-HCl (pH 7.6)、25 mM NaCl、0.1 mM DTT、および4 mM EDTAを100 μL加えます。
4. 競合実験にGDP、GTP、またはヌクレオチドローディングが必要かどうかに応じて、100 mM GDP12 μl、10 mMグアノシン5'-[γ-チオ]三リン酸(GTPγS)12 μL、またはヌクレオチドなしを60 μlのGST-Rac1ビーズに加えます。
5. ヌクレオチドローディングコントロールでは、残りのビーズを3つの10 μLアリコートに分割し、各チューブに2 μLの100 mM GDP、2 μLの10 mM GTPγS、またはヌクレオチドなしを追加します。
6. ビーズミックスを30°Cで30分間攪拌しながらインキュベートします。
7. 実験用ミックスに1 M MgCl₂:3 μlを添加し(ステップ4.4)、各コントロールミックスに0.5 μlを添加して(ステップ4.5)、ヌクレオチド結合Rac1を安定化させます。

5. コンペティションバインディング

1. 6本のマイクロチューブを設置し、それぞれに以下が含まれています:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6)、20 mM MgCl₂
   ヌクレオチドをロードした実験用Rac1ビーズ10 μl(ステップ4.7以降)
   5 μl Rac1-binding protein A (constant binding protein)
2. 各チューブに、0、1、2.5、5、10、または20 μlのRac1結合タンパク質B(可変結合タンパク質)を加えます。これらの容量は、一定結合タンパク質と可変結合タンパク質のストック濃度がほぼ等しいと仮定しており、調整が必要な場合があります。
   1. 結合タンパク質AとBの結合親和性に大きな違いがある場合は、結合タンパク質AとBの量を調整し、これは実験の繰り返しを通じて経験的に決定する必要があります。50 mM Tris-HCl (pH 7.6) と 20 mM MgCl₂ を添加して、結合混合物の総容量を 235 μl にします。
3. 以下を含むマイクロチューブをセットアップします:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6)、20 mM MgCl₂
   ヌクレオチドをロードした実験用Rac1ビーズ10 μl(ステップ4.7以降)
   10 μl Rac1-binding protein A (constant binding protein)
4. GDP、GTPγS、およびヌクレオチド制御チューブなしのセットアップ:
   200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6)、20 mM MgCl₂
   ステップ 4.5 で GDP、GTPγS、またはヌクレオチドなしでロードし、ステップ 4.7.
   で安定化した 10 μl コントロールの Rac1 ビーズ 180 μl HEK293T GFP-TrioD1ライセート、ステップ3.6
   に従って調製 4 μl 1 M MgCl₂
5. 混合物を2時間インキュベートし、4°Cで反転して混合します。
6. ビーズを50 mM Tris-HCl(pH 7.6)と20 mM MgCl₂で3回洗浄します。
7. 20 μLの還元性サンプルバッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7)、5% SDS、20%グリセロール、0.02 mg/mLブロモフェノールブルー、5%β-メルカプトエタノール)に結合したタンパク質を溶出します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バグバスター	ノヴァゲン	70584から3
コンプリートプロテアーゼ阻害剤	ロシュ	05 056 489 001
グルタチオン磁気ビーズ	刺す	88821
ポリエチレン、分岐、平均MW~25,000	シグマ・アルドリッチ	408727から100ミリリットル
オピメム	ライフテクノロジー	31985-047
ダルベッコのモディファイドイーグルメディア	シグマ・アルドリッチ	D5796
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	10270*1-6
L-グルタミン	ライフテクノロジー	〒25030-024
GFP Trap_A	クロモテック	GTA-20
国内総生産	シグマ・アルドリッチ	G7127	非常に不安定です。分注して、再構成後すぐに-80で保管
GTPγS	シグマ・アルドリッチ	G8634	非常に不安定です。分注して、再構成後すぐに-80で保管
ブロッキングバッファ	シグマ・アルドリッチ	B6429
Tween-20 (トゥイーン 20	シグマ・アルドリッチ	P9416
抗GFP抗体	リビングカラー	632592	1/1000希釈で使用
DyLight 800標識ヤギ抗ウサギ二次抗体	フィッシャーサイエンティフィック	10733944
Odyssey SA 赤外線イメージングシステム	リコー	9260-11パソコン