ウイルス抗原に対する血清中の抗体アイソタイプを検出するためのウイルス抗原マイクロアレイアッセイ

要約

出典:Khan, S., et al., Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、インフルエンザウイルス株の抗原性サブタイプが印刷されたマイクロアレイスライドを使用して、複数のヒト血清サンプル中の抗体アイソタイプを検出するプロセスを実演します。

プロトコル

1. インフルエンザ抗原マイクロアレイを作製する

1. 抗原をマイクロアレイスライドに印刷
   1. 各凍結乾燥抗原を、0.001% Tween-20(T-PBS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で0.1 mg/mLの濃度に再構成します。再構成した各抗原10 μLを、未処理の384ウェル平底プレートの個々のウェルに移します。
   2. 少量のマイクロアレイスポッティングピンを備えたマイクロアレイプリンターを使用して抗原を印刷し、抗原をサンプルチャネルに吸引し、直接接触と毛細管現象を介して16パッドニトロセルロースコーティングガラススライドに堆積します。
      1. 印刷ソフトウェア(Gridderなど)をソースプレートの構成と印刷パラメータでプログラムします。
         1. プルダウンメニューを使用して、この印刷方法で使用するプレートタイプの名前を選択します。この研究では、未処理の384ウェル平底プレートを使用します。
         2. [プレート数]の横にあるテキストボックスを選択し、この印刷プロトコルで使用されるサンプルプレートの数を入力します。この研究では、1枚のプレートを使用します。
         3. この方法で使用するピン構成を選択します。この研究では、8ピン構成を使用します。
         4. 原点オフセットが、スライドの原点(管理セクションでキャリブレーションされます)とスライド上の印刷ピンが印刷を開始する位置との間の距離(X方向とY方向)であることを確認します。
         5. [Array Design]タブを使用して、配列のサイズと形状(ドット間隔とサブ配列あたりのドット数)を定義します。この研究では、324 個のスポット (直径 180 μm、間隔 300 μm) を 16 パッド スライドに 18x18 形式で 8 ピンを使用して印刷します。
         6. 印刷ピンがサンプルをピックアップして分注する方法のパラメーターを選択します。この研究では、各ピンに 250 nL の抗原溶液を吸引し、40 個のスポット (8 本のピンすべてに対して合計 20 枚のスライド) に 1 nL を印刷
         します
         7. ピンクリーニングプロトコルとブロッティングプロトコルを設定します。この研究では、各ピンプリント抗原を超音波処理洗浄容器中の滅菌ddH₂Oに浸し、次いで次の抗原を吸引する。
         8. サンプルブロックをスライドに印刷する順序を定義します。アレイソフトウェアは、各マイクロアレイ内の抗原の配置を記述するために、注釈付きグリッドインデックス(.gal)ファイルを作成します
            手記：上段は、イメージング中にグリッドを配向するための基準(イメージングに使用されるすべての波長で蛍光を発する、例えば、この研究ではQdot 585 nmストレプトアビジンコンジュゲートとQdot® 800 nmストレプトアビジンコンジュゲートの混合物)に使用されます。長時間のプリントでは、ソースプレート中の抗原をピペッティングで上下させてから遠心分離することで定期的に再懸濁するか、新しいソースプレートを調製して使用することができます。
   3. プローブされていないマイクロアレイスライドを耐光ボックスに入れ、デシケーターキャビネットに室温で保管して長期保存してください
      手記： この時点で、プロトコルは無期限に一時停止される可能性があります。
2. 品質管理チェックの実施(ポリヒスチジンタグが必要)
   1. スライドをプロービングチャンバーに取り付け、ステップ2.1.1-2.1.2で説明し、図1に示すようにブロッキングバッファーでリハイドレートします。
   2. マウスモノクローナルpoly-His抗体をろ過した1xブロッキングバッファーで1:100に希釈します
      手記：未精製のタンパク質抗原(例:in vitro転写および翻訳システムで発現)を直接使用してマイクロアレイをプリントする場合は、タンパク質発現系の成分(例:大腸菌溶解物)を血清希釈に使用したブロッキングバッファーと1:10の比率で添加し、これらの成分に対する抗体をブロックします。
   3. 吸引後、アレイパッドを含む各スライドチャンバーに希釈したpoly-His抗体100 μLを添加し、室温で2時間、またはシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。ステップ2.2.1の説明に従って、T-TBSバッファーで3回洗浄します。ビオチン標識ヤギ抗マウスIgG二次抗体をブロッキングバッファーで1:200に希釈し、吸引後にウェルあたり100 μLを添加し、シェーカーで室温で1時間インキュベートします。T-TBSバッファーで3回洗浄します。
   4. Qdot 585 nmストレプトアビジンコンジュゲートをブロッキングバッファー中で4 nMに希釈し、吸引後にウェルあたり100 μLを添加し、シェーカー上で室温で1時間インキュベートします。T-TBSバッファーで3回洗浄し、次にTBSバッファーで1回洗浄します(Tweenなし)。
   5. ステップ2.2.5 – 3.1.2.
      で説明されているように、スライドを分解して定量化します 手記： この品質管理プロトコルを使用するには、タンパク質抗原にHis10タグが含まれている必要があります。あるいは、別のタグが含まれている場合は、そのタグの抗体またはリガンドを使用して品質管理チェックを実施することもできます。

2. マイクロアレイを用いたインフルエンザ抗体の血清のプローブ

1. 血清をマイクロアレイ上でインキュベートし、抗体結合を行います。
   1. マイクロアレイスライドをクリップを使用してチャンバーに取り付け、図2.
      に示すようにフレームに配置します 手記： マイクロアレイパッドに手や器具で触れることは常に避けてください。スライドがパッド面を上にして、右上隅に小さなノッチがあるように向きを変えてください。
   2. ろ過した1xブロッキングバッファーのウェルあたり100 μLでマイクロアレイスライドを再水和し、100 μLのブロッキングバッファーで血清を1:100に希釈します(未処理の96ウェルプレートまたは2 mLチューブを使用できます)。再水和したマイクロアレイスライドをカバー付きフレームに入れ、希釈した血清を室温で30分間、100〜250 rpmのオービタルシェーカーで別々にインキュベートします。その後のすべてのインキュベーションステップをシェーカーで同様に実行します.
      手記：血清は、凍結融解サイクルを最小限に抑えるために長期保存のために分注して-80°Cで凍結し、使用前にボルテックスして混合し、遠心分離して微粒子を除去する必要があります。このステップ中およびステップ後にスライドチャンバーを注意深く観察して、スライドチャンバーの再組み立てが必要な漏れを検出します。
   3. 二次収集フラスコを備えた真空ラインに接続されたピペットチップを使用して、パッドに触れずに各チャンバーの角からブロッキングバッファーを慎重に吸引します。後続のすべての吸引ステップを同様に実行します。パッドが乾燥しないように、吸引後すぐに希釈したセラをパッドに加えます。
   4. 蓋付きのフレームを、湿ったペーパータオルで囲み、蒸発を防ぐために密封した二次容器内のトレイに入れます。ロッキングシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします(あるいは、オービタルシェーカーの室温で100-250rpmで2時間インキュベートできます)。
2. 結合血清抗体を量子ドット標識二次抗体で標識
   1. 上記のようにチャンバーから慎重に血清を吸引し、T-TBS緩衝液(20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.05% Tween-20、ddH₂OにpH 7.5に調整してろ過し、市販のもの)を1ウェルあたり100 μL加え、100-250 rpmでオービタルシェーカーで5分間インキュベートします。この洗浄ステップを合計3回繰り返します(後続のすべての洗浄ステップも同様に実行されます)。
   2. ブロッキングバッファーで1 μMに希釈した二次抗体の混合物を調製し、使用前および使用中にピペッティングで十分に混合して均質性を維持します。
      手記：アッセイの再現性を維持するために、実験間のデータの定量的比較が計画されているすべてのプローブ実験で、各二次抗体の同じバッチを使用する必要があります。二次抗体の比濃度は、親和性に応じて変化させる必要がある場合があります。可能な限り、製造元のプロトコルに従ってください。
   3. 最終洗浄後にチャンバーからバッファーを吸引し、二次抗体混合物のウェルあたり100 μLを添加し、シェーカーで室温で2時間インキュベー
   トします。
   4. 二次抗体混合物を吸引し、T-TBSバッファーで3回洗浄した後、TBSバッファーで1回洗浄します(Tweenなし)。
   5. パッドに触れないようにチャンバーからマイクロアレイスライドを慎重に分解し、ろ過したddH₂Oで穏やかにすすぎ、50 mLチューブに入れて500 x gで10分間遠心分離して乾燥させます。
   6. プローブしたマイクロアレイスライドを耐光ボックスに入れ、デシケーターキャビネットに室温で保管して長期保存します
      手記：この時点で、プロトコルは最大 1 週間一時停止できます。

>3. マイクロアレイ内の抗原への抗体結合を定量する

1. マイクロアレイスライドを可視化し、スポット蛍光強度を定量化して抗体結合を測定します。
   1. 内蔵ソフトウェアを備えたポータブルイメージャを使用して、マイクロアレイスライドの画像を取得します。
      1. 「イメージャーの設定」タブで、適切なスライド構成を選択します。この研究では、16パッドスライドを使用します。
      2. Image Controlタブでは、適切な蛍光チャンネルを選択し、セラの反応性に応じてゲイン、露光時間、取得時間を調整して、最適な画像を得ることができます。本研究では、IgAとIgGの蛍光チャネルはそれぞれ585 nmと800 nmで、イメージング設定はゲイン50、露光時間500 ms、取得時間1秒でした。
      3. 「キャプチャ」をクリックして、画像の取得プロセスを開始します
         手記： マイクロアレイスライドは、暗く乾燥して保存されている限り、信号を劣化させることなく、複数の設定で再イメージングできます。スライドと互換性がある場合は、他のイメージングシステムを使用できます。
2. フィデューシャル マーカーに基づいて方向付けられたグリッドを使用して配列スポットを検出し、スポットの周囲で測定されたピクセル強度からバックグラウンドを引いた中央値としてスポット強度を測定します。この定量化アルゴリズムは、ステップ1.1.2で作成した.galファイルを使用して、各マイクロアレイ上の個々の抗原にスポット強度を結びつける組み込みのイメージャーソフトウェアを使用してバッチで実行します。
   1. [ファイル情報] パネルで、コンピューター上のフォルダーから .gal ファイルをアップロードし、[解析オプション] セクションで解析出力ファイルを保存するフォルダーを指定します。
   2. [画像制御]タブで、定量化する取得した画像の1つを開き、右上隅にある[自動]ボタンを選択します。
   3. 右下隅の[アレイ解析]セクションで、ソフトウェアの指示に従って基準テンプレートを作成します。
   4. [バッチ分析] をクリックし、定量化する画像を含むフォルダーを選択し、前の手順で作成した基準テンプレートを選択します。ソフトウェアは各画像を分析し、スポット強度を定量化します.
      手記：このステップでは、マイクロアレイ上の個々の抗原に結合する各血清検体内の抗体を定量化するスポット強度を含む.csvファイルが生成されます。これは、後でスプレッドシートの操作または分析ソフトウェアで操作できます。
3. 生データを解析して、抗原間および血清検体間での抗体結合を比較します。この研究では、585 nmおよび800 nmの蛍光スポット強度として測定されたIgAおよびIgG抗体を、異なる日に異なるスライドを使用して実験の2つの独立した実行間ですべての抗原にわたって比較し、アッセイの再現性を測定するために相関分析を行いました
   手記：発現混合物としてプリントされた未精製タンパク質の場合、データ解析はDNAコントロールなしのバックグラウンド減算から始める必要があります。

結果

図1:インフルエンザ抗原マイクロアレイの印刷およびプロービングプロトコルの概略図。 左から右へ、ニトロセルロースでコーティングしたスライド上にマイクロアレイを印刷し、量子ドット標識二次抗体を用いて血清のIgGおよびIgA抗体をプローブし、ポータブルイメージャーでスライドをイメージングし、結果を解析してヒートマップを生成します。

図2:マイクロアレイスライドにプロービングチャンバーを取り付ける手順。 AからFまで、プロービングチャンバ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16パッドニトロセルロースコーティングガラススライド	Grace Bio Labs	305016
1x GVS FASTブロッキングバッファ	フィッシャーサイエンティフィック	10485356
ArrayCamポータブルイメージャー	Grace Bio Labs	400S	マイクロアレイスポットの分解能と量子ドットの励起波長と発光波長を達成できる場合、他のイメージングデバイスを使用してスライドを視覚化できます。
ビオチン標識ヤギ抗マウスIgG抗体	サーモフィッシャー
HiBase 384ウェルプレート	グライナー バイオワン	T-3037-11
マイクロアレイピン	ArrayItの	GMP2	各マイクロアレイプリンターには、独自のカスタムマイクロアレイピンが必要な場合があります。
マウスモノクローナルポリ-His 抗体	シグマ・アルドリッチ	H1029
OmniGrid 100マイクロアレイプリンター	GeneMachinesの		この作業で使用されたマイクロアレイプリンターのバージョンはもはや市販されていませんが、更新された同様の機器はDigilab(マサチューセッツ州ホプキントン)のOmniGridAccentマイクロアレイプリンターであり、同じプロトコルはほとんどの市販のマイクロアレイプリンターで実行できます。
ProPlateスライドチャンバー	Grace Bio Labs
ProPlateスライドクリップ	Grace Bio Labs	204838
ProPlateスライドフレーム	Grace Bio Labs	246879
量子ドット 585 nm 標識ヤギ抗ヒト IgA 抗体	Grace Bio Labs
量子ドット 585 nm ストレプトアビジンコンジュゲート	サーモフィッシャー	Q10111MP
Quantum dot 800 nm 標識ヤギ抗ヒト IgG 抗体	Grace Bio Labs